Aufklärung der Mechanismen der DNS Einzelstrangbruch (ESB) Reparatur in Pflanzen

• Antragsteller: Professor Dr. Holger Puchta
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen ; Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 372598077

Einzelstrangbrüche (ESBs) kommen in Pflanzengenomen viel häufiger vor als Doppelstrangbrüche (DSBs). Durch die Verfügbarkeit von hochspezifischen Endonukleasen war es in den letzten 25 Jahren möglich, im Detail DSB Reparatur bei multizellulären Eukayonten aufzuklären. Dies gilt sowohl für die Mechanismen als auch für die darin involvierten Proteine. Erst vorkurzem wurde es durch den Gebrauch des CRISPR/Cas Systems möglich, hochspezifisch unikale ESBs an jeder gewünschten Stelle im Genom zu induzieren. Der vorliegende Antrag zielt nun darauf ab, unter Verwendung der erwähnten Technologie die Natur der ESB Reparatur bei der Modelpflanze Arabidopsis thaliana zu untersuchen. Wir konnten bereits zeigen, dass ein unikaler ESB die homologe Rekombination (HR) zwischen tandemartig duplizierten Sequenzen massiv erhöhen kann. In dem vorgeschlagen Projekt soll nun durch den Einsatz bereits verfügbaren Mutanten von Enzymen, die in DNA Reparatur und Rekombinationvorgänge involviert sind, herausgefunden werden, welche dieser Faktoren auch bei der ESB induzierte HR eine Rolle spielen. Da wir bereits früher zeigen konnten, dass T DNA in einem induzierten DSB integrieren kann, wollen wir nun auch testen, ob ESBs sequenzspezifischen T DNA Integration initiieren können. Weiterhin haben wir gefunden, dass im Gegensatz zu einem unikalen ESB, die Induktion von zwei ESBs in den zwei gegenläufigen Strängen der DNA in räumlichen Nähe (bis 100 Basenpaare [bps]) zu vielfältigen Mutationen, wie Deletionen aber auch durch fill in Synthese zu Insertionen kommt. Unser Ziel ist es nun, die für diese Mutationen verantwortlichen Enzyme durch Mutanten-Analyse zu identifizieren. Eine weitere wichtige Frage ist, wie weit die zwei EZBs voneinander entfernt sein müssen, dass sie nicht länger mutagen sind. Dafür werden wird das mutagene Potenzial von EZBs in Abständen zwischen 100 bps und 2 kb (wenn notwendig auch länger) untersuchen, die sowohl überstehenden 5 als auch 3 Enden aufweisen. Dies soll sowohl für eu wie heterochromatische Genomregionen getestet werden. Mit der Aufklärung der Mechanismen der ESB Reparatur hoffen wir auch die Grundlage zur Entwicklung neuer, auf der ESB Induktion beruhender Methoden der pflanzlichen Gentechnologie zu legen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen