Hochleistungs-Auxiliare für eine cysteintolerante native chemische Peptidverknüpfung an beliebigen Aminosäuren

• Antragsteller: Professor Dr. Oliver Seitz
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 367109134

Durch die Native Chemical Ligation (NCL) von ungeschützten Peptidthioestern mit ungeschützten Cysteinylpeptiden gelingt es, Proteine in definierter posttranslationaler Modifizierung darzustellen. Allerdings schränkt die Notwendigkeit für Cystein die Anwendungsbreite der NCL ein. Zwar erweitert die gegenwärtig häufig verwendete Ligations-Entschwefelungs-Methode das Repertoire der NCL-Reaktionen, allerdings ist der Aufwand zur Etablierung der Mercaptoaminosäurebausteine zu hoch, um beliebige Ligationsschnittstellen erschließen zu können. Nachteilig ist auch, dass Cysteinreste, die nicht an der NCL teilnehmen sollen, geschützt werden müssen. Bei NCL-Methoden, die auf der Verwendung von Auxiliargruppen beruhen, ist nur ein einziger Baustein nötig, der im Idealfall auf beliebige Verknüpfungsstellen anwendbar sein sollte. Die bislang dokumentierten Auxiliare sind jedoch entweder sterisch zu aufwendig, so dass Verknüpfungen nur an Glycin-Schnittstellen gelingen, oder die Ablösung des Auxiliars zieht ungeschützte Cysteinseitenketten in Mitleidenschaft.Ziel dieses Vorhabens ist es, die erste allgemein anwendbare Methode zu entwickeln, welche unabhängig von der Ligationsstelle eine rasche Verknüpfung der Peptidfragmente ermöglicht und in Gegenwart von ungeschützten Cysteinresten eingesetzt werden kann. Wir werden Hochleistungsauxiliare entwickeln, die i) an einer beliebigen kommerziellen Aminosäure im letzten Schritt der Festphasenpeptidsynthese eingeführt werden können; ii) in der NCL hohe Reaktivität auch an sterisch aufwendigeren Verknüpfungsstellen vermitteln; iii) unter milden Bedingungen ohne Nebenreaktionen rasch abgelöst werden können, ohne hierbei iv) ungeschützte Cysteinreste zu beeinträchtigen.Um diese Ziele zu erreichen, werden wir mit 2-Seleno-2-phenethyl- und 2-Mercapto-2-arylethyl-Gerüsten neue Auxiliarklassen etablieren. Die Auxiliare sind haben geringen sterischen Anspruch, so dass NCL-Reaktionen über einen 5-gliedrigen Übergangszustand sehr rasch ablaufen werden. Unter radikalischen Bedingungen wird eine Fragmentierungsreaktion ausgelöst, die das Zielprotein liefert, ohne unbeteiligte Cysteinseitenketten zu behelligen. Bei der Proteintotalsynthese werden mit Leu-Thr-, Gln-Asn-, Leu-His- und Ile-Met-Kupplungen erstmals Ligationsschnittstellen etabliert, die existierenden Methoden der Native Chemical Ligation bislang verwehrt bleiben.Die Nützlichkeit der Methode wird in der Totalsynthese von SH3-Domänen der Adapterproteine p130Cas und NEDD9 erprobt. Die Funktionalität der Zielproteine wird in Bindungsexperimenten mit bekannten Liganden dokumentiert. Durch die Totalsynthese/ und Charakterisierung ortsspezifisch phosphorylierter p130Cas- und NEDD9-Proteinen werden wir ergründen, ob die SH3-Domänen einen Phosphoschalter haben, mit dem das Erkennungsrepertoire und damit die zelluläre Signaltransduktion reguliert werden kann.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen