Su(H) als Ziel der Repression des Notch Signalwegs in Drosophila

• Antragsteller: Dr. Dieter Maier
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 357709120

Eumetazoen nutzen den Notch-Signalweg zur Zell-Zell-Kommunikation, dessen Regulation wegen vieler Notch-abhängiger Humanerkrankungen von größtem Interesse ist. Eine Aktivierung des Notch Rezeptors hat zur Folge, dass die intrazelluläre Notch Domäne (ICN) gemeinsam mit dem CSL-Transkriptionsfaktor Notch-Zielgene aktiviert. Ohne Notch-Signal legt CSL in einem Repressorkomplex die Notch-Zielgene still. Dieser besteht in Drosophila u.a. aus dem CSL-Homolog Su(H) und Hairless (H). Zusammen mit R. Kovall (Cincinnati) bestimmten wir die Kristallstruktur des H-Su(H) Komplexes und bestätigten diese in vivo: über hydrophobe Kontakte dringt H tief in Su(H) ein. Dabei ändert sich dessen Konformation, so dass keine ICN-Bindung mehr möglich ist. Mit der Methodik des Gene Engineerings wurden gezielt Mutationen in H und Su(H) Loci eingeführt und analysiert. Wir konnten zeigen, dass Su(H)-bindedefekte H Allele einer Nullmutante ähneln, also H primär Notch reprimiert. Zudem haben wir spezifische H*NLS Allele erzeugt, deren Kernimport defekt ist. Weiterhin erstellten wir drei H-bindedefekte Su(H) Allele. Diese sind rezessiv letal und zeigen einen Notch-Funktionsgewinn, was die Notwendigkeit der Notch-Repression für die Fliegenentwicklung beweist. Schließlich beobachteten wir, dass nicht nur die subzelluläre Lokalisation von Su(H), sondern auch seine Stabilität von einer Bindung an H oder ICN abhängt. Ziel dieses Projektes ist ein vertieftes Verständnis der Notch-Signalrepression. Uns interessiert die Dynamik des Übergangs von Aktivierung zu Repression. Dazu wollen wir die subzelluläre Lokalisation und Stabilität von H und Su(H) untersuchen, sowie funktionelle und strukturelle Verbindungen zur Chromatinregulation, insbesondere zwischen H und dem Histon-Chaperon Asf1. Zuerst wird der Beitrag der nukleären Lokalisationssignale in H erfasst. H*NLS Allele sowie das DNA-bindedefekte Su(H)S5 Allel werden genutzt, um die Su(H) Lokalisation und Stabilität in Abhängigkeit von Kernlokalisation bzw. DNA-Bindung zu klären. Die Su(H) Halbwertszeit soll mit hitzeinduzierbaren Su(H) Konstrukten in S2 Zellen und in vivo ermittelt, sowie der Beitrag des Proteasoms untersucht werden. Mutation potentiell ubiquitinierter Lysinreste in Su(H) bzw. RBP-J soll helfen, den jeweiligen Beitrag zur Su(H) Stabilität aufzuklären. Die molekulare Interaktion zwischen H und Asf1 soll im Hefe 2-Hybridsystem und im Reportersystem analysiert werden. Um den Beitrag von Asf1 an der H vermittelten Repression der Notch-Zielgene zu untersuchen, wird die Asf1-H Interaktionsdomäne in vitro mutagenisiert. Neben Überexpressions- und Zellkulturstudien werden spezifische H bzw. Asf1 Allele erzeugt, erstere per Gene Engineering, letztere via Crispr/Cas9. Diese Arbeiten sind als Kollaboration mit R. Kovall (Cincinnati), mit S. Bray (Cambridge) bzw. mit F. Oswald (Ulm) geplant.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen