DNA Rekrutierung, Regulation & Funktion von SMC5/6

• Antragsteller: Dr. Markus Räschle
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323666480

Komplexe Mechanismen regulieren die Architektur der Chromosomen. Proteinkomplexe der SMC Familie (Cohesin, Condensin, SMC5/6) spielen hierbei eine zentrale Rolle. Cohesin und Condensin bilden ringförmige Strukturen, welche DNA Stränge umfassen. Während Cohesin die Schwesterchromosomen (sister chromatids) zusammenhält - vom Moment ihrer Entstehung (DNA Replikation) bis kurz vor der Zellteilung - erlaubt Condensin die Verdichtung der Chromosomen und erleichtert so die Aufteilung einer Kopie der Chromosomen auf die Tochterzellen. Die genaue Funktion von SMC5/6 ist unklar. Die Inaktivierung von SMC5/6 führt zu einem Zellzyklusarrest in der Mitose oder zur fehlerhaften Vererbung des Genoms. Es wird daher vermutet, dass eine fehlerhafte Regulation von SMC5/6 zur Krebsentstehung beiträgt und Krebsveranlagungen zugrunde liegen könnte.Hier schlagen wir vor, die Funktion von SMC5/6 in Xenopus Ei-Extrakten zu untersuchen. Unsere Vorversuche zeigen, dass SMC5/6 in einer strikt replikations-abhängigen Weise auf Plasmid DNA geladen wird. Die plasmid-gebundenen Proteine werden mit hierfür neu entwickelten, proteomischen Methoden analysiert. So können wir nicht nur SMC5/6 sondern beispielsweise auch Cohesin oder alle bei der Replikation beteiligten Faktoren zeitlich aufgelöst identifizieren und quantifizieren.Mit diesem einzigartigen System wollen wir folgende Fragen beantworten:1) Wann und wie wird SMC5/6 auf die DNA geladen?Zuerst werden wir proteomische Rekrutierungsprofile erfassen. Die zeitaufgelöste Akkumulierung von Proteinen auf intakten und beschädigten Plasmiden wird zeigen, wann genau SMC5/6 auf welche Substrate geladen wird. Die zeitabhängige Akkumulierung von anderen Proteinen wird die Suche nach regulatorischen Faktoren unterstützen. Wir klären, ob SMC5/6 Ringe bilden kann, und ob eine topologische Bindung der Substrate vorliegt. Wir untersuchen, wie die SMC ATPase, sowie die Sumo und Ubiquitin E3 Ligase Aktivität von SMC5/6 die DNA Bindung beeinflussen.2) Was sind die Funktionen von SMC5/6?Wir werden Reagenzien herstellen, die uns erlauben, den SMC5/6 Komplex oder dessen Ladefaktoren von den Ei-Extrakten zu entfernen und allfällige Defekte durch rekombinante Proteine wiederherzustellen. Mittels etablierter Verfahren analysieren wir Replikations- und Reparaturintermediate. Diese Experimente werden uns direkte Hinweise auf eine mögliche Funktion von SMC5/6 in der Entwirrung von Replikationsprodukten (decatenation) oder in spezifischen Schritten verschiedener DNA Reparaturwegen geben.Die Kombination eines physiologischen und biochemisch kontrollierbaren in vitro Systems mit hochsensitiven proteomischen Methoden erlaubt uns zum ersten Mal, gleichzeitig die transiente Akkumulierung von DNA Intermediaten und aller involvierter Proteinfaktoren zu beobachten. Wir erwarten, dass die vorgeschlagenen Experimente neue Einblicke in die Regulation und Funktion von SMC5/6 gewähren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Schweiz
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Stephan Gruber