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Projekt
Illuminant Myogenese: Optogenetik zur Untersuchung der Differenzierung von Myoblasten und der Muskelregeneration
Antragstellerinnen / Antragsteller
Dr. Olivier Kassel; Professorin Barbara Di Ventura, Ph.D.
Fachliche Zuordnung
Zellbiologie
Förderung
Förderung von 2016 bis 2023
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315384510
Die Regeneration der Skelettmuskulatur beruht auf dem Prozess der Myogenese. Bei Muskelverletzungen werden adulte Muskelstammzellen aktiviert und bilden eine Population von proliferierenden Progenitorzellen, die sogenannten Myoblasten. Diese differenzieren dann weiter zu Precursorzellen, die Myocyten, welche zu Myotuben fusionieren, welche schließlich zu Muskelfasern reifen. Die Myogenese wird durch verschiedene Signalwege reguliert, die in hohem Maße zeitgesteuert sind. Darüber hinaus üben einige dieser Wege verschiedene Funktionen in verschiedenen Stadien der Myogenese aus. Zum Beispiel ist der mechanistic target of rapamycin-complex 1 (mTORC1)-Weg dynamisch reguliert und scheint im gesamten Myogeneseprozess eine entscheidende Rolle zu spielen. Aufgrund dieser komplexen Regulation, erfordert die Erforschung der genauen Stadien-spezifischen Funktion von mTORC1 eine hohe zeitliche und räumliche Präzision, die durch optogenetische Werkzeuge/Methoden erbracht werden kann. Während der ersten Phase des SPP haben wir die Dynamik der mTORC1-Aktivität während der Myogenese charakterisiert. Darüber hinaus haben wir in vitro und in Zebrafischembryonen Werkzeuge validiert, um endogene mTORC1-Aktivität in Form einer konstitutiv aktiven und einer dominant negativen Mutante des mTORC1-Aktivators RHEB zu manipulieren. Überraschenderweise legen unsere Ergebnisse nahe, dass die Wirkung von mTORC1 auf das Muskelwachstum durch eine noch nicht charakterisierte Funktion des Komplexes im Zellkern vermittelt wird. Parallel dazu haben wir wesentliche Fortschritte bei der Entwicklung eines innovativen, auf AsLOV2-Domänen basierenden, optogenetischen Werkzeugs für das Licht-induzierte Proteinspleißen (LIPS) erzielt. LIPS ermöglicht die Intein vermittelte Rekonstitution zweier inaktiver Fragmente eines Proteins in ein funktionelles Protein, kontrolliert durch blaues Licht. In Anbetracht der Tatsache, dass unsere ursprünglichen Konstrukte bereits im Dunkeln aktiv waren, haben wir mehrere Kontrollmechanismen implementiert. Proof-of-Principle-Experimente mit diesen neuen Designs zeigten die Robustheit des Systems. In der zweiten Phase werden wir LIPS auf RHEB-Mutanten anwenden, um die Stadien-spezifische Rolle des mTORC1 bei der Myogenese in vitro und bei der Muskelregeneration in Zebrafischembryonen zu untersuchen. Darüber hinaus werden wir LIPS weiterentwickeln, um die unkontrollierte Proteinrekonstitution im Dunkeln weiter zu reduzieren und um eine lokalisierte, lichtinduzierte Rekonstitution mit subzellulärer räumlicher Präzision zu ermöglichen. Unter Verwendung des am besten geeigneten LIPS-Designs werden wir schließlich die zytosolischen und nukleären Funktionen von mTORC1 bei der Regulierung des Muskelwachstums im Zebrafischembryo untersuchen. Wir werden auch die allgemeine Anwendbarkeit von LIPS aufzeigen. Daher stellt LIPS eine wichtige Ergänzung zur optogenetischen Toolbox dar.
DFG-Verfahren
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