Detaillierte funktionelle Charakterisierung von Chloroplasten-lokalisierten mTERF Proteinen

• Antragstellerin: Privatdozentin Dr. Tatjana Kleine
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 310039167

Ohne Organellen-Genexpression (OGE) kann keine Pflanzenentwicklung stattfinden. Jedoch sind die Mechanismen, die OGE kontrollieren immer noch weitestgehend unbekannt. So benötigt die OGE diverse Zellkern-kodierte Proteine, die sowohl Transkription, Spleißen, Trimmen und Editieren der Organellen-RNAs als auch ihre Translation durchführen. Mitglieder der sogenannten mitochondrialen Transkriptionsterminations-Familie (mTERF), die in Metazoen und Pflanzen vorkommen, regulieren die OGE auf verschiedenen Ebenen. Jedoch sind wir erst am Anfang, die Details der Wirkungsweisen der mTERF Proteine zu verstehen. In unseren Vorarbeiten wurden 10 mTERF Proteine identifiziert, die mit hoher Wahrscheinlichkeit in Chloroplasten lokalisiert sind; zudem haben wir die Funktion von einem mTERF - mTERF6 - eingehender charakterisiert. Das mTERF6 Protein ist in den Chloroplasten und Mitochondrien lokalisiert, und ein komplettes Fehlen von mTERF6 führt zur Letalität auf Keimlingsebene. Außerdem interagiert mTERF6 mit einer RNA-Sequenz im Chloroplasten-Gen für Isoleucin-tRNA (trnI.2). Das mTERF6 Protein kann auch mit DNA gleicher Sequenz interagieren, was in vitro zur Transkriptionstermination führt. In vivo ist mTERF6 an der trnI.2-Reifung beteiligt. Die Hauptziele unseres Projektes sind (i) die Aufklärung der molekularen Funktion des mTERF6 Proteins, und (ii) die Bestimmung der molekularen Funktionen der übrigen 10 mutmaßlich Chloroplasten-lokalisierten mTERF Proteine. Dazu möchten wir Aminoacylierungen weiterer Organellen-tRNAs in einer Mutante mit reduzierter mTERF6 Akkumulation untersuchen, und alle post-transkriptionellen Modifikationen von trnI.2 sollen mit RNA-Massenspektrometrie bestimmt werden. In einem zweiten Schritt, werden Interaktionspartner von mTERF6 mit einer Kombination aus pull-down und guilt-by-association Methoden identifiziert. Zusätzliche molekulare Funktionen von mTERF6 können mit Hilfe von Chloroplast-weiten RNA-Sequenzierugen gefunden werden. Darüber hinaus sollen die 10 ausgewählten mTERF Proteine eingehender untersucht werden, wobei zum Teil die Methoden der mTERF6-Charakterisierung herangezogen werden können. Dafür werden eine Reihe von biochemischen, molekularbiologischen und Next-Generation-Sequenzierungs-Techniken angewendet, wie z. B. RNAi, Protein-Überexpression, GFP-Lokalisierungen, Transkriptionsterminations-Assays und Stress-Behandlungen. RNA-Massenspektrometrie, und RIP- und DIP-Sequenzierungs-Analysen werden helfen, die molekularen Funktionen der vielversprechendsten mTERFs aufzuklären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen