Vorwärtsprogrammierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen zu Chondrozyten durch forcierte Überexpression von SOX9
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ein Hauptproblem von Chondrozyten, die in vitro aus Stammzellen wie mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (BMSCs) differenziert werden, ist die ungewollte hypertrophe Degeneration, gegenüber der artikuläre Chondrozyten (ACs) resistent sind. Als Vorläufer aller adulter Gewebe, sind induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) theoretisch in der Lage, stabilen artikulären Knorpel zu bilden. Die Differenzierung von iPSCs zu Chondrozyten in vitro ist jedoch komplex, mit einem hohen Zellverlust behaftet, und ob ein AC-ähnlicher Phänotyp und Hypertrophie-Resistenz erreicht werden kann, ist bisher unklar. Ziel dieses Projektes war humane iPSCs zu Chondrozyten zu dierenzieren, die nicht-hypertrophen Knorpel bilden und ACs bei der Knorpelregeneration und anderen Anwendungen ersetzen können. Primäre Hypothese war, dass die Überexpression des chondrogenen Haupttranskriptionsfaktors SOX9 die bisher eingeschränkte In-vitro-Chondrogenese von iPSCs verbessern und die Vorwärtsprogrammierung zu Chondrozyten erlauben könnte. Die Überexpression von SOX9 wurde erfolgreich etabliert, jedoch erwies sich die iPSC-Chondrogenese als äußerst anfällig gegenüber schädlichen Viruseffekten, die SOX9 an keinem der getesteten Entwicklungsstadien retten konnte. SOX9-Überexpression in BMSCs zu Beginn der Chondrogenese war unzureichend, um die Differenzierung in die gewünschte chondrale statt der unerwünschten osteochondralen Richtung zu verlagern. Während der Differenzierung von nicht-transduzierten iPSCs korrelierte das geringe Zellüberleben mit einer geringen Expression vieler Extrazellulär-Matrix-Gene und von Integrinsignalweg-verwandten Molekülen sowie einem geringen Aggregationsvermögen von intermediären mesodermalen Progenitoren zu Beginn der Chondrogenese. Ein kurzer WNT/-catenin-Aktivierungspuls zu Beginn der iPSC-Differenzierung erwies sich als Schlüsselschritt, um dem Hauptteil der mesodermalen Progenitoren die Teilnahme an der Pelletbildung zu ermöglichen, indem die Expression von Extrazellulärmatrixgenen und die Zellaggregation stark erhöht wurden. Damit wurde der hohe Zellverlust während der Chondrogenese erfolgreich verhindert. Darüberhinaus etablierten wir ein neues Differenzierungsprotokoll für iPSCs, bei dem die Chondrogenese durch TGF- ohne zusätzlichen Einsatz von pro-hypertrophen Knochenmorphogeneseproteinen (BMPs) angetrieben wurde. Die so aus iPSCs differenzierten Chondrozyten waren juvenilen Chondrozyten sehr ähnlich und lagerten doppelt so viel Proteoglykan pro Zelle ab als adulte ACs. Von Bedeutung war, dass hypertrophe Marker sowohl auf Genexpression- als auch auf Proteinebene in Knorpelersatzgewebe hergestellt ausgehend von iPSCs abwesend oder genauso niedrig blieb wie in Knorpelersatzgewebe, das von ACs gebildet wird. Dies belegte ein Ausbleiben der hypertrophen Degenerierung, die BMSCs für die klinische Knorpelregeneration disqualifiziert. Dies ist der erste experimentelle Nachweis einer chondralen In-vitro-Differenzierung humaner iPSCs zu Chondrozyten, die gegenüber der hypertrophen Degeneration resistent sind. Damit wurde das Hauptziel dieses Projektes, wenn auch durch eine alternative Herangehensweise, erreicht. Die neuen Erkenntnisse eröffnen neuartige Strategien, um Stammzellen dem Einsatz in der klinischen Knorpelregeneration, als Krankheitsmodelle und in pharmakologischen Studien näher zu bringen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Gegensätzliche frühe Regulation von SOX9-Protein bei der In-vitro-Chondrogenese von iPS-Zellen im Vergleich zu MSCs. Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2016)
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(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/978-3-319-37076-7_1-1) - Induzierte pluripotente Stammzellen als alternative Zellquelle für die Knorpelregeneration: Chondrogenese ohne unerwünschte Mineralisierungsaktivität Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2018)
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(Siehe online unter https://doi.org/10.1055/s-0040-1717236) - Initial WNT/β-Catenin Activation Enhanced Mesoderm Commitment, Extracellular Matrix Expression, Cell Aggregation and Cartilage Tissue Yield from Induced Pluripotent Stem Cells. Front Cell Dev Biol
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(Siehe online unter https://doi.org/10.3389/fcell.2020.581331) - Juveniler artikulärer Knorpel aus unbegrenzt verfügbaren induzierten pluripotenten Stammzellen. Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2020), Zeitung für Orthopädie und Unfallchirurgie 5/20, 09.10.2020
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(Siehe online unter https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00081)
