De novo-Strukturvorhersage von helikalen Transmembranproteinen mit RosettaTMH unter Verwendung von Pseudocontact Shift NMR-Daten
Biochemie
Biophysik
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Membranproteine stellen ein Drittel aller Proteine im menschlichen Genom und mehr als die Hälfte aller pharmakologischen Zielstrukturen dar. Sie spielen eine Schlüsselrolle in vielen biochemischen Prozessen z.B. als Ionenkanäle, Rezeptoren, Transporter oder Enzyme. Dennoch bleibt ihre experimentelle Strukturaufklärung schwierig. Nur ca. 2-3% aller Proteinstrukturen in der Proteindatenbank stammen von Membranproteinen und nur jede Zehnte von ungefähr 1000 Membranproteinfamilien ist durch wenigstens eine experimentelle Struktur in der Proteindatenbank vertreten. Wenn keine homologe Proteinstruktur vorhanden oder eine experimentelle Strukturbestimmung nicht möglich ist, muss die Proteinstruktur de novo vorhergesagt werden. Die Genauigkeit der Vorhersage kann drastisch durch die Inkorporation einer geringen Anzahl an experimentellen Strukturinformationen, z.B. aus der Kernmagnetresonanz (NMR)-Spektroskopie verbessert werden. In diesem Forschungsprojekt wurden Methoden entwickelt, die Daten aus paramagnetischen NMR-Messungen in Algorithmen für die de novo-Strukturvorhersage von helikalen Transmembranproteinen integrieren. Lanthanoidionen und Nitroxid-Spinlabel, die ortsspezifisch in Proteine eingeführt werden können, rufen weitreichende abstands- und orientierungsabhängige Effekte hervor, die eine Strukturvorhersage leiten und generierte Strukturmodelle verifizieren können. Die paramagnetischen Effekte mit dem größten Strukturinformationsgehalt, PCS, RDC und PRE, wurden in Form von Energiemethoden in Rosetta, einer Software-Plattform zur Modellierung von Biomolekülen, implementiert. Ein integrativer Ansatz der Proteinstrukturvorhersage mit Rosetta wurde entwickelt, in dem paramagnetische NMR-Daten zusammen mit lokalen NMR-Effekten, wie z.B. chemischen Verschiebungen, kombiniert werden, was zu einer gesteigerten Genauigkeit und Qualität der Proteinmodelle führt. Die Wirksamkeit dieses integrativen Modellierungsansatzes wurde zuerst für eine umfangreiche Testgruppe aus 36 löslichen monomeren und symmetrischen Proteinen mit experimentellen PCS-, RDC- und PRE-Daten demonstriert. Nachfolgend wurden paramagnetische NMR-Daten in den RosettaTMH-Algorithmus, einer Methode speziell für die Vorhersage von helikalen Transmembranproteinen, integriert. In einer Fallstudie für das Membranprotein pSRII mit simulierten PCS-Daten erzeugte die Methode mehr Modelle mit korrekter Topologie (RMSD100 < 8Å) und erlaubte die Vorhersage des Transmembranhelixbündels mit einer Genauigkeit bis 3.6 Å. Eine weitere Steigerung der Genauigkeit ist durch Verbesserungen am RosettaTMH-Algorithmus zu erwarten. Um die Messung von paramagnetischen NMR-Daten zu beschleunigen, als Ausgangspunkt für die Aufklärung neuer Membranproteinstrukturen und die Erprobung von computergestützten Methoden, wurde ein experimentelles Protokoll für die selektive Markierung mit Lanthanoidionen etabliert. Mittels der nichtkanonischen Aminosäure p-Azido-L-Phenylalanin wird ein rigider DOTA-Lanthanoid-Komplex an das Protein angehängt. Die Anwendung dieses Protokolls auf das E.coli Transmembranprotein DsbB ermöglichte die Messung von PCS- und RDC-Daten als Grundlage für seine de novo-Strukturvorhersage. Die Methode ist auf noch unbekannte Membranproteine unkompliziert erweiterbar, für dessen Aufklärung sie wichtige Strukturinformationen liefern wird. Ergänzend zu meinen Arbeiten mit paramagnetischen NMR-Daten, habe ich im Rahmen von Kooperationen, die das Meilerlab mit anderen nationalen und internationalen Forscherteams unterhält, an der Strukturaufklärung physiologisch wichtiger Membranproteine, z.B. den Bradykinin-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, dem K+-Ionenkanälen KCNQ1 und der Antibiotikaresistenz-vermittelnden Histidinkinasen NsaS, gearbeitet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Mechnisms of KCNQ1 channel dysfunction in long QT syndrome involving voltage sensor domain mutations. Sci Adv, 2018, 4(3), eaar2631
Huang H, Kuenze G, Smith JA, Taylor KC, Duran AM, Hadziselimovic A, Meiler J, Vanoye CG, George AL Jr, Sanders CR
(Siehe online unter https://doi.org/10.1126/sciadv.aar2631) - The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nat Chem Biol, 2018, 14(3), 284-290
Joedicke L, Mao J, Kuenze G, Reinhart C, Kalavacherla T, Jonker HRA, Richter C, Schwalbe H, Meiler J, Preu J, Michel H, Glaubitz C
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/NCHEMBIO.2551)
