Molekulare und strukturelle Muster parazellulärer Poren durch subtypabhängige Claudin-Claudin-Wechselwirkungen in Tight Junctions
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Struktur/Funktions-Studien der extrazellulären Loops (ECL) von Claudinen sollten zur Klärung parazellulärer Abdichtungsmechanismen beitragen. Durch Kombination von bioinformatischen, strukturellen und molekularbiologischen Untersuchungen sollten Determinanten identifiziert und Perspektiven für pharmakologische Interventionen eröffnet werden. Hierfür sollten unter gezielter Ausnutzung unterschiedlicher Porenbildungsfunktion und Sequenzunterschiede im ECL1 von Claudin-1 und -2 molekulare Muster parazellulärer Wechselwirkungen für Kanalbildung und Dichtheit identifiziert werden. In der ersten Förderperiode wurden Einzelmutationen analysiert. Diese Untersuchungen wurden in der zweiten Förderperiode insbesondere mittels Mehrfachmutation im ECL1 weitergeführt, um zusammenwirkende Aminosäure-Ensembles, welche die spezifische Porenfunktion von Claudin-2 bewirken, aufzudecken. Das Clostridium perfringens-Enterotoxin (CPE) stört die Tight Junction-Ausbildung von Claudin-3/-4. Unter Ausnutzung der vorliegenden CPE-Kristallstruktur sollte die komplette Bindungstasche im CPE kartiert werden. Durch gezielte Mutationen, sollten die selektiven Wechselwirkungsmuster von CPE für Claudin-3 herausgearbeitet und die unterschiedlichen molekularen Determinanten identifiziert werden, die eine Interaktion von CPE mit anderen Claudinen verhindern. Ziel war es, genau diese negativen Determinanten an CPE durch modellbasierte ortsgerichtete Mutation so zu verändern, um eine gezielte komplementäre Interaktion mit einem spezifischen Claudin-Subtyp (z.B. Cldn5 oder -1) zu generieren, mit dem CPEwt nicht interagiert. Modifiziertes CPE sollte zur (a) subtypspezifische Modulation der Claudine zwecks verbesserter Wirkstoffaufnahme oder (b) Therapie Claudin-überexprimierender Tumoren vorbereitet werden. Aminosäurereste, die zur Kanalfunktion der Claudine beitragen, wurden untersucht, indem Cldn1/Cldn2 Chimärmutanten in MDCK Zellen exprimiert wurden und deren Effekt auf den transepithelialen Wiederstand (TER) und die Ionenpermeabilität charakterisiert wurde. ECL1-Reste des abdichtenden Cldn1 wurden durch entsprechende Reste des kanalbildenden Cldn2 ersetzt. Hierüber wurden Hinweise erhalten, dass S53 und E48 in der Abdichtung des parazellulären Spalts beteiligt sind und dass die Bildung Ladungs-unabhängiger Poren durch die S53E-Substitution induziert werden könnte. Um die molekularen Grundlagen der Claudin-Assemblierung und der daraus resultierenden Barriere- oder Porenbildung zu verstehen, wurden Struktur-Funktionsstudien zu Cldn3 und -5 in enger Verbindung des TP6 und einem im DFG-Einzelverfahren geförderten Projekt durchgeführt. Der molekulare Mechanismus der Bindung des Clostridium perfringens-Enterotoxins (CPE) an Cldn3 und Cldn4 wurde aufgeklärt und genutzt, um CPE-Varianten mit veränderten Claudin-Bindungseigenschaften zu generieren. Der molekulare Mechanismus der differentiellen Bindung des Clostridium perfringens-Enterotoxins (CPE) an Cldn3 und Cldn4, nicht aber an Cldn1 und Cldn5, wurde aufgeklärt und genutzt, um eine CPE-Variante mit zu generieren, die hochaffin an Cldn5 bindet. cCPE-Varianten wurden erfolgreich eingesetzt, um BBB-TJs in vitro transient zu öffnen, die Hepatitis C-Infektion von Hepatozyten zu inhibieren und TJs während der Entwicklung des Hühnerembryos und des Zebrafisch-Embryos zu modulieren. Als weitere TJ-Modulatoren wurden Alkylglycerole getestet, beziehungsweise der Mechanismus der durch sie vermittelten transienten parazellulären Öffnung der Bluthirnschranke charakterisiert. Volllängen-CPE wurde verwendet, um Cldn3- und - 4-überexprimierende Tumorzellen in vitro und in vivo anzugreifen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2008) Formation of tight junction: determinants of homophilic interaction between classic claudins. FASEB J. 22: 146-158
Piontek J, Winkler L, Wolburg H, Müller SL, Zuleger N, Piehl C, Wiesner B, Krause G, Blasig IE
- (2008) Structure and function of claudins. Biochim. Biophys. Acta 1778(3): 631-645
Krause G, Winkler L, Mueller SL, Haseloff RF, Piontek J, Blasig IE
- (2009) Molecular determinants of the interaction between Clostridium perfringens enterotoxin and claudin-3. J. Biol. Chem. 284(28): 18863-18872
Winkler L, Wenzel A, Gehring C, Piehl C, Mueller SL, Krause G, Blasig IE, Piontek J
- (2009) Structure and function of extracellular claudin domains. Ann. N.Y. Acad. Sci. 165: 34-43
Krause G, Winkler L, Piehl P, Blasig I, Piontek J, Müller SL
- (2010) Establishment of the ependymal cerebral barrier by claudin-5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(4): 1425-1430
Zhang J, Piontek J, Piehl C, Otten C, Richter J, Christ A, Liss M, Willnow T, Wolburg H, Blasig IE, Abdelilah-Seyfried S
- (2010) Participation of the second extracellular loop of claudin-5 in paracellular tightening against ions, small and large molecules. Cell. Mol. Life Sci. 67(12): 2131-2140
Piehl C, Piontek J, Cording J, Wolburg H and Blasig IE
- (2011) Elucidating the principles of the molecular organization of heteropolymeric tight junction strands. Cell. Mol. Life Sci. 68(23): 3903-3918
Piontek J, Fritzsche S, Cording J, Richter S, Hartwig J, Walter M, Yu D, Turner JR, Gehring C, Rahn HP, Wolburg H, Blasig IE
- (2012) Determinants contributing to claudin ion channel formation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1257(1): 45-53
Veshnyakova A, Krug SM, Mueller SL, Piontek J, Protze J, Fromm M, Krause G
- (2012) Mechanism of Clostridium perfringens enterotoxin interaction with claudin-3/-4 protein suggests structural modifications of the toxin to target specific claudin. J. Biol. Chem. 287(3): 1698-1708
Veshnyakova A, Piontek J, Protze J, Waziri N, Heise I, Krause G
- (2012) Novel Clostridium perfringens enterotoxin suicide gene therapy for selective treatment of claudin-3 and -4 overexpressing tumors. Gene Ther. 19(5): 494-503
Walther W, Petkov S, Kuvardina ON, Aumann J, Kobelt D, Fichtner I, Lemmm M, Piontek J, Blasig IE, Stein U, Schlag PM
- (2013) In tight junctions, claudins regulate the interactions between occludin, tricellulin and marvelD3, which, inversely, modulate claudin oligomerization. J. Cell. Sci. 126(2): 554-564
Cording J, Berg J, Käding N, Bellmann C, Tscheik C, Westphal JK, Milatz S, Günzel D, Wolburg H, Piontek J, Huber O, Blasig IE
- (2014) Claudin-3 and claudin-5 folding and assembly into the tight junction are controlled by non-conserved residues in TM3 and ECL2 segments. J. Biol. Chem. 289(11): 7641-7653
Rossa J, Ploeger C, Vorreiter F, Saleh T, Protze J, Günzel D, Wolburg H, Krause G, Piontek J
- (2014) Molecular and structural transmembrane determinants critical for embedding claudin-5 into tight junctions reveal a distinct fourhelix bundle arrangement. Biochem. J. 464(1): 49-60
Rossa J, Protze J, Kern C, Piontek A, Günzel D, Krause G, Piontek J
- (2015) Assembly and function of claudins: Structure-function relationships based on homology models and crystal structures. Sem. Cell Dev. Biol. 42: 3-12
Krause G, Protze J, Piontek J
- (2015) Directed structural modification of Clostridium perfringens enterotoxin to enhance binding to claudin-5. Cell. Mol. Life Sci. 72(7): 1417-1432
Protze J, Eichner M, Piontek A, Dinter S, Rossa J, Blecharz KG, Vajkoczy P, Piontek J, Krause G
- (2015) Molecular determinants of anion channel properties of claudin-17. Cell. Mol. Life Sci. 72
Conrad MP, Piontek J, Günzel D, Fromm M, Krug SM
- (2015) Probing the cis-arrangement of prototype tight junction proteins claudin-1 and claudin-3. Biochem. J. 468: 449-458
Milatz S, Piontek J, Schulzke JD, Blasig IE, Fromm M, Günzel D
- (2015) Specific binding of Clostridium perfringens enterotoxin fragment to Claudin-b and modulation of zebrafish epidermal barrier. Exp. Dermatol. 24(8): 605-610
Zhang J, Ni C, Yang Z, Piontek A, Chen H, Wang S, Fan Y, Qin Z, Piontek J
