Die Rolle der intrazellulären Antigenprozessierung in der Induktion eines selektiven Graft versus Leukämie Effektes ohne Graft versus Host Erkrankung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Trennen von GvL Effekt und GvHD ist ein essentieller Schwerpunkt in der Forschung zur Verbesserung des Outcomes der allogenen Stammzelltransplantation. Basierend auf unserer Beschreibung von 2 Gruppen endogener HLA Klasse II restringierter Antigene, die sich unterschiedlich gegenüber dem Einfluss von HLA-DM verhalten, stellten wir die Hypothese auf, dass DM-sensitive Antigene (solche, deren Präsentation durch HLA-DM verhindert wird und nur durch Co-expression von HLA-DO ermöglicht wird) einen selektiven Graft-versus- Leukämie Effekt ermöglichen könnten. Dies beruht auf der Tatsache, dass HLA-DO nicht durch inflammatorische Zytokine hochreguliert wird und es daher im Rahmen einer Inflammation zwar zu einer Hochregulation von HLA Klasse II kommt, aber auch HLA-DM hochreguliert wird und dies bei fehlender Hochregulation von HLA-DO die Präsentation DM-sensitiver Antigene verhindert. Es ist jedoch unklar, ob DM-sensitive Antigene eine vergleichbare Immunogenität wie DM-resistente Antigene aufweisen. Wir generierten ein in vitro System basierend auf den beiden Modellantigenen OVA und DBY. Zunächst etablierten wir murine Zelllinien, die entweder H2-M oder H2-O (murines HLA-DM und HLA-DO) über-exprimierten und testeten mit diesen Zelllinien Erkennung des OT-2 Epitopes von OVA sowie des Marylin Epitops von DBY. In einem nächsten Schritt wurden Mutationen in diese T-Zell Epitope eingeführt, um eine Epitop Variante mit gegensätzlichen Verhalten gegenüber H2-M (HLA-DM) zu generieren. Nachdem jeweils vergleichbare Varianten etabliert worden waren, wurde diese in Vakzinierungsversuchen in vivo getestet. Weiterhin wurden Tumorzelllinen mit den DM-sensitiven und DM-resistenten DBY Varianten generiert, um die Anti-Tumor Immunität in vivo zu testen. Zuletzt sollte noch der Einfluss der DM-sensitivität auf die Entstehung einer GvHD nach allogener Stammzelltransplantation getestet werden. Mit diesen Experimenten konnten wir zeigen, dass das OT-2 Epitop von OVA zu einer deutlich stärkeren T-Zell Aktivierung in der Anwesenheit von HLA-DO/H2-O aufwies und damit DM- sensitiv ist. Im Gegensatz hierzu war die T-Zell Erkennung des Marylin Epitops von DBY nicht von der Expression von HLA-DO/H2-O abhängig und ist damit DM-resistent. Indem wir zwischen einer und drei Punktmutationen in die T-Zell Epitope einführten, konnten wir eine weitere DM-sensitive Variante und zwei DM-resistente Varianten von OVA generieren. Ebenso, generierten wir DM-resistente und DM-sensitive Varianten von DBY. Nach Vakzinierung von C57BL/6 Mäusen mit den verschiedenen Epitop-Varianten konnten wir vergleichbare Expansion und Reaktivität von OVA- und DBY-spezifischen T-Zellen sowohl in als auch ex vivo zeigen. Die Generierung von Tumorzelllinien mit entsprechenden Proteinkonstrukten wurde durchgeführt und in vitro deren T-Zell Erkennung getestet. Hier zeigte sich eine starke Erkennung aller Varianten mit einem geringen Unterschied in Form einer etwas schwächeren Erkennung der DM-sensitiven Varianten. Das in vivo Tumormodell ist etabliert. Die Durchführung der Injektion der generierten Tumorzelllinien ist noch nicht abgeschlossen und wird in Kürze durchgeführt. Da die Identifikation der DM-sensitiven Varianten von DBY länger gedauert hat und komplizierter war als geplant, ist die Generierung des transgenen Mausmodells mit dem mutierten DBY noch nicht abgeschlossen. Aufgrund des Fortschritts der Technologie mittels CRISPR/Cas9 entsprechende Punktmutationen in die Keimbahn einzubringen, ist dieses Mausmodell aktuell in einem Kooperationsprojekt in Arbeit. Das GvHD Modell mit dem alleinigen Transfer von Marylin T-Zellen wurde in der wildtyp Maus etabliert.
