Kleine regulatorische RNAs in Agrobacterium tumefaciens

• Antragsteller: Professor Dr. Franz Narberhaus
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 289473898

Bakterielle kleine RNAs (small RNAs = sRNAs) regulieren eineVielzahl von zellulären Prozessen, in den meisten Fällen durchkomplementäre Basen-Paarung mit Ziel-mRNAs. In dempflanzenpathogenen Bakterium Agrobacterium tumefaciens wurdenmittels Hochdurchsatz-Sequenzierung Hunderte von sRNAs entdeckt.Für detaillierte Analysen haben wir drei sRNAs ausgewählt, vondenen aufgrund ihrer differentiellen Expression anzunehmen war,dass sie eine regulatorische Funktion unter bestimmten WachstumsoderStressbedingungen haben. AbcR1 ist weit verbreitet undkoordiniert die Produktion zahlreicher ABC-Transporter. In dervergangenen Förderperiode haben wir gefunden, dass diekleeblattförmige sRNA L5 ein überlappendes Set an ABCTransporternreguliert. Ein weiterer ABC-Transporter wird durchPmaR (Peptidoglycan biosynthesis, motility and ampicillin resistanceRegulator) kontrolliert. PmaR stellte sich als überaus interessantesRNA heraus, weil sie Gene der Zellwand-Biosynthese und einerBeta-Laktamase positiv reguliert. Dieses Ergebnis erklärt die schonlange bekannte natürliche Resistenz von Agrobacterium gegenüberAmpicillin. Das beantragte Fortsetzungsprojekt verfolgt zwei Ziele:Erstens die Regulation von Genen durch diese drei sRNAs näher zucharakterisieren und zweitens deren eigene differentielle Regulationzu verstehen. Im ersten Teilprojekt wollen wir detaillierte Einblicke inseparate und überlappende Ziel-Gene der ausgewählten sRNAserhalten. Hierzu werden wir das Transkriptom der entsprechendenDeletionsmutanten mittels RNA-Seq analysieren. AusgewählteKandidaten werden anschließend mittels quantitativer Realtime-PCRund biochemischen RNA-RNA-Interaktionsstudien validiert. ZurUntersuchung der zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismenwerden RNA-Stabilitätsmessungen und Ribosom-RNAInteraktionsstudien(toeprinting assays) durchgeführt. Ein charakteristisches Merkmal regulatorischer RNAs ist, dass sie selberdifferentiell exprimiert werden, um ihre Funktion bei wechselndenUmweltbedingungen auszuüben. Wir haben den bemerkenswertenBefund gemacht, dass die drei oben genannten sRNAs durchdenselben Regulator, den LysR-type Transkriptionsfaktor LsrB,reguliert werden. Dies lässt vermuten, dass viele der bislangbeschriebenen LsrB-Zielgene nicht direkt durch denTranskriptionsfaktor, sondern indirekt über sRNAs reguliert sind. Umgenomweit die direkten DNA-Bindestellen von LsrB zu identifizieren,werden wir CHAP-Seq (CHromatin-Affinity Purification andSequencing) durchführen. Im Anschluss werden ausgewählteBindestellen mit Hilfe von EMSAs (Electrophoretic Mobility ShiftAssays) näher charakterisiert. Insgesamt erwarten wir von diesenUntersuchungen detaillierte Einblicke in ein faszinierendesregulatorisches Netzwerk aus Protein- und RNA-Komponenten, daseinem ubiquitären pflanzenpathogenen Bakterium ein Überleben ineiner komplexen Umwelt ermöglicht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen