Transport of Ammonium across Prokaryotic and Eukaryotic Membranes
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ammonium-Transporter (Amt) bilden eine weit verbreitete Klasse von integralen Membranproteinen, welche als Importer oder Exporter für reduzierten Stickstoff in Form des Ammonium-Kations, NH4+, fungieren. Ihre Orthologen in Säugetieren sind die Rhesus-Glykoproteine, für die zusätzlich auch eine Funktion als CO2-Transporter postuliert wurde. Das ursprüngliche Hauptaugenmerk unserer Arbeiten war Ammoniumtransport in Archaea und unsere Studien basieren weitgehend auf dem Euryarchaeon Archaeoglobus fulgidus, das drei individuelle Amt-Proteine besitzt, als Modellsystem. Wir haben die dreidimensionalen Strukturen von Af-Amt1 und vor kurzem auch von Af-Amt2 gelöst, ebenso wie die der zugehörigen Regulatorproteine Af-GlnK1 und Af-GlnK2. Die komplexe Interaktion dieser Bindungspartner wird durch den Energiestatus der Zelle sowie den Bedarf an Stickstoff geregelt und wir haben die Funktionsweise der GlnK-Proteine mit Hilfe von Röntgenkristallographie und isothermaler Titrationskalorimetrie untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen die ausgeprägte positive und negative Kooperativität der drei Bindestelten und die mit der Bindung einhergehenden, konformationellen Änderungen in einem regulatorischen Loop, welche für die Interaktion mit den Membran-Transportproteinen verantwortlich sind. Parallel zu diesen Arbeiten wurden mehrere weitere Mitglieder der Amt-Familie untersucht, insbesondere zwei Proteine die vermutlich eher als Ammonium-Sensoren denn als Transporter arbeiten und die intrazelluläre Signalkaskaden auslösen, indem sie cytoplasmatische Signaltransduktionsdomänen aktivieren. Im Fall von Amt5 aus K. stuttgartiensis ist diese Domäne eine Histidinkinase, bei Amt1 aus S. denltrificans handelt es sich um eine GGDEF-Domäne, welche den erst vor Kurzem entdeckten Second Messenger cyclo-Diguanylat synthetisiert. Beide Protein waren bis dahin vollständig uncharakterisiert. Wir haben die Holoproteine sowie die Membran- und Signaltransduktionsdomänen beider Proteine exprimiert und aufgereinigt und haben jüngst auch qualitativ hochwertige Kristalle von Sd-Amt1 erhalten. Funktionelle Studien konnten die Phosphorylierung von Ks-Amt5 und die Produktion von zyklischem Diguanylat durch Sd-Amt1 in Gegenwart von Ammonium zeigen. Obwohl die Identifikation der jeweiligen Kaskaden und Interaktionspartner noch aussteht, weisen diese Arbeiten eine vollständig neue Richtung in der Untersuchung von Ammoniumtransportern. In Zusammenarbeit mit Prof. Wolf Frommer, Stanford, haben wir unsere funktionellen Arbeiten auf die Rolle des G-Terminus der Amt-Proteine ausgedehnt und Af-Amt2 mit seinen Orthologen aus A. thaliana verglichen. Der C-Terminus interagiert mit dem benachbarten Monomer im Amt-Trimer und ist in der Tat funktionell hoch relevant. In einer weiteren Kollaboration mit Prof. Matthias Ullmann, Bayreuth, wurden Berechnungen zum Transportmechanismus durchgeführt, auf deren Basis eine Reihe von Punktvarianten erzeugt wurde, die wir derzeit funktionell und strukturell charakterisieren. Im Hinblick auf die direkte Beobachtung der Funktion von Amt-Proteinen in Abhängigkeit von pH-Gradienten und Membranpotential in künstlichen Lipiddoppelschichten ergeben sich trotz ständiger Fortschritte bislang dadurch erhebliche Schwierigkeiten, dass Ammonium im Gleichgewicht mit dem hoch membranpermeablen Gas Ammoniak, NH3, steht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2007) The Amt/Mep/Rh Family of Ammonium Transport Proteins, Molec. Memb. Biol., 24, 357-365
Andrade S.L.A. and Einsle O.
- (2009) Pore Mutations in Ammonium Transporter Amt1 with Increased Electrogenic Ammonium Transport Activity, J. Biol. Chem., 284(37), 24988-24995
Loqué D., Mora S.I., Andrade S.L.A., Pantoja O. and Frommer W.B.
