Die Rolle der Autophagie-vermittelten Pellino3a-Degradation im TLR4-Signalweg in Makrophagen

• Antragsteller: Professor Dr. Andreas von Knethen
• Fachliche Zuordnung: Public Health, Gesundheitsbezogene Versorgungsforschung, Sozial- und Arbeitsmedizin
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 284401149

Die Lipopolysaccharid (LPS)-vermittelte Aktivierung des Toll-like-Rezeptors 4 (TLR4) bewirkt in Makrophagen eine Entzündungsantwort. Diese Entzündungsreaktion wird durch Autophagie begrenzt. Diesbezüglich konnten wir zeigen, dass die Expression von Pellino3a, das im TLR4-Signalweg als E3-Ubiquitinligase und Gerüstprotein wirkt, nach LPS-Stimulation in Makrophagen Autophagie-abhängig reguliert wird. Der Stabilisierung und Proteinzunahme 6 h nach LPS-Stimulation folgt eine fast vollständige Abnahme der Pellino3a-Proteinexpression nach 24 h. Verantwortlich für die Pellino3a-Degradation ist die Bindung des Autophagie-Adapterproteins p62/SQSTM1. Unklar ist aber, wie es zur frühen Pellino3a-Proteinzunahme kommt. Da Pellino3a in Makrophagen essentiell für die LPS-TLR4-vermittelte Expression proinflammatorischer Zytokine wie IL-1beta, TNFalpha, IL-6 und IFNgamma ist, stellen wir die Hypothese auf, dass die Inhibition der initalen Pellino3a-Zunahme die hyperinflammatorische Antwort blockiert. Da für die Regulation der Expression von Pellino3a im entzündlichen Geschehen keine mechanistischen Befunde vorliegen, charakterisieren wir zuerst durch Massenspektrometrie (MS) bzw. einen Fluoreszenz-polarisierungsassay, welche Modifikation(en) von Pellino3a und/oder p62/SQSTM1 ihre Interaktion bedingen und überprüfen, ob die Autophagieinduktion und der Pellino3a-Abbau durch Überexpression von p62/SQSTM1 oder pharmakologisch durch Torin2 beschleunigt und so die proinflammatorische Zytokinexpression vermindert wird. Dabei berücksichtigen wir, dass Keap1 ebenfalls an p62/SQSTM1 binden kann und bestimmen mittels FACS-FRET-Analyse, ob die Bindung zu Pellino3a dadurch gehemmt und so Pellino3a stabilisiert wird. Wir klären mittels MS, ob Pellino3a-vermittelte Ubiquitinierungen von anderen Proteinen zum Abbau beitragen. Wir analysieren auch, inwieweit die Pellino3a-Protein-expression bei Sepsis transkriptionell moduliert wird und damit zur Hemmung der Pellino3a-Expression genutzt werden kann. Diese Experimente werden in J774A.1 und RAW264.7 Makrophagen durchgeführt, nachdem endogen Pellino3a und p62/SQSTM1 mittels CRISP/Cas9 getaggt wurden. Ziel ist zu klären, wie die frühe Zunahme der Pellino3a-Proteinexpression verhindert werden kann, um diesen Mechanismus anschließend im in vivo Ansatz des Endotoxinmodells in der Maus zu überprüfen. Wir gehen von der Überlegung aus, dass die Hemmung der Pellino3a- oder p62/SQSTM1-Expression in Makrophagen die hyperinflammatorische Phase in vivo unterdrückt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Kooperationspartner: Dr. Phillip Grote; Professor Dr. Eugen Proschak