Erkennung und Spaltung von Substraten durch die mitochondriale Rhomboidprotease PARL

• Antragsteller: Professor Dr. Marius Lemberg
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 263531414

Rhomboide sind Serinproteasen, die in allen Lebensformen vorkommen und eine Vielzahl wichtiger zellulärer Prozesse beeinflussen. Während die Analyse bakterieller Rhomboide erste Einblicke in den Mechanismus der Substraterkennung ergeben hat, wurde die entfernt verwandte mitochondriale Rhomboidprotease PARL bisher nicht im Detail untersucht. Zen-trale Ziele dieses Projektes sind die Ermittlung neuer PARL Substrate und die Entschlüsse-lung von Spaltungsdeterminanten. Von besonderer Bedeutung ist die invertierte Topologie des aktiven Zentrums, die sich von klassischen Rhomboidproteasen unterscheidet. Dies deutet darauf hin, dass PARL einen einzigartigen Mechanismus zur Substraterkennung auf-weist. Obwohl in früheren Arbeiten, mittels klassischer Genetik und Kandidaten-Tests, ver-schiedene Proteine identifiziert wurden, die durch PARL geschnitten werden können, ist die Relevanz einiger dieser Befunde derzeit noch unklar. Wir und andere Arbeitsgruppen haben jüngst entdeckt, dass die mit Morbus Parkinson assoziierte Proteinkinase PINK1, ein physio-logisches PARL Substrat darstellt. Interessanterweise haben wir beobachtet, dass Krank-heits-assoziierte Mutationen und der Austausch konservierter Helix-destabilisierender Seitenketten mit der PARL-katalysierten Spaltung von PINK1 in Zusammenhang stehen. Ein Einfluss durch Helix-destabilisierende Seitenketten ist auch in Substraten anderer Intra-membranproteasen zu finden. Dies gibt einen Hinweis auf gemeinsame Prinzipien, denen die Proteolyse innerhalb von Membranen unterliegt. Hier schlagen wir vor, durch systematische proteomisch Untersuchungen das physiologische Substrat-spektrum von PARL zu bestimmen und die PARL Substratspezifität in einem Zell-freien System zu testen. Spezifische Ziele sind: 1.) Systematische Identifikation physiologischer PARL Substrate 2.) Charakterisierung der Spaltungsdeterminanten3.) Untersuchung der konformationellen Flexibilität der PINK1 TransmembranhelixZu diesem Zweck planen wir die Entwicklung eines Testsystems welches eine detaillierte kinetische Untersuchung von Detergenz-solubilisiertem und gereinigtem PARL und ausge-suchter Substrate ermöglichen wird. Die Schnittstellenbestimmung von physiologischen, so-wie artifiziellen PARL-Substraten, durch massenspektrometrische Analyseverfahren, wird als wichtige Quelle zur Ermittlung des PARL Schnittstellenkonsensus dienen und die Entwick-lung eines Algorithmus zur Substratvorhersage ermöglichen. Zusammen mit den biophysikali-schen Untersuchungen, die im Rahmen der Forschergruppe durchgeführt werden, wird diese Sequenzanalyse voraussichtlich aufzeigen, wie die Dynamik von Transmembrandomänen die PARL-katalysierte Spaltung beeinflusst.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 2290: Intramembrane Proteolyse Verstehen