Nachweis und funktionelle Charakterisierung von Queuosin und m5C Modifikationen in RNA

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Ann Elizabeth Ehrenhofer-Murray; Professor Dr. Frank Lyko
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277246736

tRNAs tragen eine Vielzahl von chemischen Modifikationen, welche die Funktion der tRNAs in der Translation modulieren. In diesem Projekt untersuchen wir zwei dieser Modifikationen, Queuosin (Q) und 5-Methylcytosin (m5C). Unsere Vorarbeiten in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe haben gezeigt, dass Dnmt2-vermittelte Methylierung von C38 in tRNA-Asp durch Q, welches Guanosin an der wobble-Position (Q34) im Antikodon bestimmter tRNAs ersetzen kann, stark stimuliert wird. Interessanterweise wird Q von Eukaryoten nicht selbst synthetisiert, sondern über bakterielle Bestandteile der Nahrung sowie über die Darmflora aufgenommen. Q stellt somit eine wichtige Verbindung zwischen der Nährstoffverfügbarkeit und der Proteintranslation dar.In der vergangenen Förderperiode des SPP1784 haben wir die Rolle von Q und Dnmt2 in der globalen Proteintranslation untersucht. Unsere mittels Ribosome Profiling gewonnenen Resultate zeigten einen klaren Effekt auf die Geschwindigkeit von Q codons in S. pombe und in menschlichen Zellen. Darüberhinaus unterdrückte die Q-Modifikation das fehlerhafte Ablesen ähnlicher Codons in S. pombe, was eine weitere Rolle von Q in der Steuerung der Proteintranslation aufzeigte. Des weiteren haben wir computerbasierte Verfahren für die Analyse Transkriptom-weiter Bisulfit-Sequenzierungsdatensätze etabliert und so das vollständige S. pombe tRNA-Methylierungsmuster und seine Abhängigkeit von Q, Dnmt2 und den beiden S. pombe Trm4/ NSun2 Homologen bestimmt. Dies zeigte eine bemerkenswerte Selektivität von Dnmt2 für tRNA-Asp und eine klar definierte Arbeitsteilung der beiden Trm4 Homologe in der Methylierung anderer tRNA-Positionen. Schließlich zeigten unsere Arbeiten auch, dass die Stimulierung von Dnmt2 durch die Q-Modifikation von tRNAs evolutionär konserviert ist, und einen neuartigen Signalweg zur ernährungsabhängigen Kontrolle der Proteintranslation in höheren Eukaryoten begründet. Diese Erkenntnisse wurden durch eine enge Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen von Ann Ehrenhofer-Murray (experimentelle Arbeiten) und Frank Lyko (bioinformatische Analysen) gewonnen. Im Rahmen des hier vorgelegten Antrags werden wir neuartige Methoden zum Nachweis von Q und m5C in RNA entwickeln. Dazu werden wir Sequenzierungstechnologien der dritten Generation, wie zum Beispiel Nanoporen-Sequenzierung und single-molecule real-time (SMRT) Sequenzierung einsetzen. Auch planen wir, Reverse Transkriptasen und RNA Endonukleasen als Werkzeuge zum Nachweis von Q und m5C einzusetzen. Wenn erfolgreich etabliert, werden wir diese Methoden auch zum Nachweis dieser Modifikationen außerhalb von tRNAs verwenden. Dies ist ein wichtiger Aspekt, da das Vorhandensein von m5C in mRNA derzeit kontrovers diskutiert wird, und da Q in der mRNA eines Humanpathogens vorkommen könnte. Zusammengenommen wird dieses Projekt neue Nachweismethoden für Q und m5C entwickeln und damit einen wichtigen Beitrag zu unserem Verständnis des Epitranskriptoms in Eukaryoten liefern.zeuge generieren, die für vergleichbare Analyse in anderen Systemen genutzt werden können.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1784: Chemische Biologie natürlicher Nukleinsäuremodifikationen