Untersuchung der Mechanismen und Funktionen post-transkriptionaler Calcium Kanal Modifikationen in Drosophila mit Hilfe genetischer Methoden

• Antragstellerin: Dr. Stefanie Ryglewski
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung seit 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 275581320

Spannungsgesteuerte Calcium Kanäle sind in vielen neuronalen Kompartimenten essentiell, z.B. für präsynaptische Vesikelfreisetzung (SV), Aktionspotentiale (APs), dendritische Rechenoperationen und Genregulation. In Verbraten werden die Funktionen von 10 Genen übernommen, die in 3 Familien eingeteilt werden: Cav1, Cav2, Cav3. Diese Calcium Kanäle assoziieren mit akzessorischen alpha2delta und beta Untereinheiten, was zu mehr als 100 Calcium Kanal Komplexen führt, deren Diversität durch Spleißen weiter erhöht wird. In Drosophila vermitteln nur drei Calcium Kanal Gene, die den Gen Familien in Vertebraten homolog sind und weniger akzessorische Untereinheiten haben, Calcium Kanal Funktion. Drosophila Cav2 Kanäle (cacophony, cac) kommen in allen neuronalen Kompartimenten vor und regulieren SV Freisetzung, APs, dendritische Eingänge und Transkription. Wir werden unter Zuhilfenahme der genetischen Möglichkeiten in Drosophila testen, ob alternatives Spleißen zweier sich gegenseitig ausschließender Exon-Paare in cac im Spannungssensor und in einem Motiv, das Bindestellen für beta und G-Protein Untereinheiten enthält, Cav2 Lokalisation und Kanaleigenschaften koordiniert, um stark unterschiedliche Funktionen zu ermöglichen. In der letzten Antragsperiode haben wir gezeigt, dass cac Kompartiment-spezifische Funktionen durch Assoziation mit unterschiedlichen alpha2delta Untereinheiten hat. Um die Rolle alternativen Spleißens für cac Lokalisation und Funktion zu untersuchen, haben wir Exons aus cac (mit und ohne Fluoreszenz-Markierung) via CRISPR entfernt. Manipulation des intrazellulären Motivs mit Bindestellen für beta und G-Protein Untereinheiten hat zu differentiellen Effekten auf synaptische Plastizität geführt. Darüber hinaus ist nur eines der beiden Exons im Spannungssensor essentiell für SV Freisetzung an schnellen glutamatergen Synapsen, wohingegen erste Daten zeigen, dass nur das andere Exon für graduierte synaptische Transmission wichtig ist. Schließlich suggerieren unsere „Patch Clamp“ Daten, dass differentielles Spleißen Kanaleigenschaften reguliert. Basierend auf unseren Daten möchten wir (1) die Rolle differentiellen Spleißens auf die biophysikalischen Eigenschaften von differentiell gespleißten cac Kanälen sowie deren Interaktion mit verschiedenen akzessorischen Untereinheiten in einem heterologen Expressionssystem untersuchen. (2) Weiterhin möchten wir die Hypothese testen, dass differentielles Spleißen von cac Kanal Lokalisation und Funktion an schnellen bzw. graduierten Synapsen dirigiert. Dies würde implizieren, dass hier eine andere Lösung als an graduierten Synapsen in Vertebraten genutzt wird, die i.d.R. Cav1 Kanäle verwenden. Um dendritische Funktion zu untersuchen, möchten wir (3) herausfinden, inwiefern cac Spleiß-Isoformen an der Integration synaptischer Eingänge in Dendriten teilhaben und wie dadurch Eingangs/Ausgangs-Beziehungen reguliert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen