Identifizierung molekularer Trigger für den zielgerichteten Transfer von Ammoniumtransportern an Membranen der Wurzelzelle.

• Antragsteller: Dr. Michael Melzer
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 271234564

Die Evolution multizellulärer Organismen bedingt die gesteigerte Notwendigkeit des Transfers und Austausches von Metaboliten und Substraten durch spezialisierte Zellen und deren Zellmembran. Die somit entwickelten vektoriellen Membrantransportsysteme der Eukaryoten sind dabei durch viele allgemeingültige Merkmale gekennzeichnet. Jedoch weist das Endomembransystemes höherer Pflanzen hierbei, durch eine Reihe von charakteristischen Faktoren, auf adaptive Spezialisierungen der pflanzenspezifischen Transportvorgänge hin. So unterliegen Nähstofftransporter, aufgrund des Standes von Nährstoffversorgung und -bedarf, einer effektiven posttranslationalen Kontrolle des Proteingehalts und deren intrazellulärer Lokalisation. Trotz weitreichender Kenntnisse über Transportwege von Makromolekülen und der daran beteiligten Proteine der Exo- und Endozytose, ist weiterhin unklar, welche intrazellulären Trigger die Prozesse auslösen und somit den aktuellen Bedarf an Transportproteinen in den Zielmembranen bestimmen. Das Ziel des vorliegenden Projekt ist die Entdeckung neuer Komponenten in der Signalkaskade des Ernährungszustands von Sticksoff (N) in Pflanzenzellen. Das Konzept des Projektes basiert hierbei in erster Linie auf der Existenz von Peptiddomänen oder Aminosäuresequenzen in Ammoniumtransportern (AMTs), die aufgrund eines veränderten N-Status oder extern verfügbarem N eine Veränderung der Membranlokalisation bewirken. Die entsprechenden Peptiddomänen werden zur Bestimmung intrazellularer Signale herangezogen, die in Abhängigkeit des N-Status die Lokalisation der AMTs verändern. Mittels GFP-Fusionsproteinen wird zunächst in einem ersten Arbeitspaket (AP1) eine Analyse der sich ändernden Lokalisation von Arabidopsis AMT1;1, AMT1;3 und AMT1;2 in Abhängigkeit des N-Ernährungszustands durchgeführt. Die Bestätigung der Ergebnisse erfolgt in einem unabhängigen biochemischen Versuchsansatz (AP2). Nach erfolgtem Domänentausch der AMTs wird eine erneute Analyse der Membranlokalisation in Abhängigkeit des N-Status durchgeführt (AP3). AMTs mit modifizierten Proteindomänen werden nun in Saccharomyces cerevisiae mit Mutation des N-Transports (delta mep1,2,3) und der Arabidopsis AMT vierfach-Mutante qko heterolog exprimiert und funktionell analysiert (AP4). Diejenigen AMT-GFP Fusionen die bei N-Mangel bzw. N-Zufuhr eine veränderte Membranlokalisation zeigen, werden anschließend zur Identifizierung molekularer Trigger des AMT Transports herangezogen. Für die abschließende in vivo Analyse der N-Status abhängigen AMT-Lokalisation werden Wurzeln transgener Arabidopsis Linien mit spezifischen Hemmstoffen für die potentiellen Trigger behandelt und mittels Lebendzell-Mikroskopie untersucht (AP5). Letztendlich sollen die Erkenntnisse der einzelnen Arbeitspakete zu einem besseren Verständnis der Prozesse führen, die von AMT Domänen unter N-Mangel oder N-Sättigung den Proteintransfer und somit den Substrattransport in Abhängigkeit molekularer Trigger in Wurzeln kontrollieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Nicolaus von Wirén