Epi-Fluoreszenz Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Gerät wurde sowohl zur Charakterisierung von genetischen Schaltern eingesetzt, als auch zur weiteren Entwicklung entsprechender mikroskopischer Messverfahren. Neuartige mikrofluidische Chips ermöglichen in vivo und in vitro Experimente an DNA-, RNA-und Licht-basierten Schaltern, die mittels der Epifluoreszenz des Gerätes untersucht wurden. Die daraus gewonnenen zeitaufgelösten Daten ermöglichen das Aufstellen und Kalibrieren von Computer-basierten Modellen und die Analyse der untersuchten biologischen Systeme. Der zeitliche Verlauf von Transkription in Hefezellen wurde mit Hilfe des Gerätes aufgelöst. Dabei konzentrierten sich die Experimente auf die Anzahl und Laufzeit von Polymerasen auf einem Gen unter Verwendung von mikrofluidischen Chips. Die gentechnisch veränderten Hefezellen zeigten einen fluoreszenten Punkt nach Induktion der Transkription. Vor allem stieg die Anzahl an aktiven Zellen mit zunehmender Stimuluskonzentration. Das Mikroskop ermöglichte es als einziges Gerät, die Intensität und Dauer dieses Punktes zu bestimmen. Ferner spielte die Zeitauflösung der aufgenommenen Bilder eine Rolle. Um den genauen Mechanismus aufzulösen, bedurfte es der erworbenen Kamera und ihrer Sensibilität. Zellfreie Expressionssysteme wurden in mikrofluidischen Reaktoren untersucht. Dies diente der Charakterisierung von RNA-basierter Regulierung von genetischen Schaltkreisen mittels Fluoreszenznachweis. Die Verwendung des Mikroskops erlaubte es, den Betrieb der Reaktoren zu überwachen und zeitgleich die Fluoreszenz auszulesen. Dabei wurden Bedingungen geschaffen, die dem Innern einer Zelle in puncto Volumen und Volumenaustausch nachempfunden waren. Zudem konnten die genetischen Schaltkreise durch eine mikroskopische peristaltische Pumpe durchmischt und länger studiert werden, als es in herkömmlichen „Ein-Topf-Reaktionen“ der Fall wäre. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Charakterisierung von genetischen Schaltkreisen in Hefen. Es wurden zum Beispiel in Zusammenarbeit mit der AG Süß diverse RNA-basierte Schaltkreise generiert und unter dem Mikroskop vermessen. Das Expressionsprofil des Reportergens GFP gab Aufschluss darüber, wie stark die verwendeten Aptamere die Genexpression beeinflussen. Die Verwendung des Mikroskops erlaubte die zeitliche Auswertung für individuelle Zellen. Ein stochastisches Computermodel war mit diesen Daten in der Lage Rückstschlüsse auf die Vorgänge in der Zelle zu ziehen. Neu- und Weiterentwicklungen der mikrofluidischen Werkzeuge zur verbesserten Charakterisierung von genetischen Schaltern wurden mit dem Mikroskop untersucht. Ein Fokus dieser Arbeiten lag auf der mikrofluidischen und enzymfreien Dissoziation von Zellaggregaten. Hierzu wurden in einer experimentellen Parameterstudie besonders gut geeignete Designs für Anwendungen an Hefen gefunden. Diese Studie wird weitergeführt mit einer Untersuchung der Dissoziierung zugrundeliegenden Strömungsmechanismen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2017). ROCnRibo: Characterizing a Riboswitching Expression System by Modeling Single-Cell Data. ACS Synthetic Biology, 6(7), 12111224
Schneider, C., Bronstein, L., Diemer, J., Koeppl, H., & Suess, B.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00322) - (2018). A tightly regulated and adjustable CRISPR-dCas9 based AND gate in yeast. Nucleic Acids Research
Hofmann, A., Falk, J., Prangemeier, T., Happel, D., Köber, A., Christmann, A., Koeppl, H., & Kolmar, H.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/nar/gky1191) - (2018). Maximizing Information Gain for the Characterization of Biomolecular Circuits. NanoCom 2018, Reykjavik, Iceland
Prangemeier, T., Wildner, C., Hanst, M., & Koeppl, H.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1145/3233188.3233217)
