Funktionelle ER Architektur

• Antragsteller: Professor Dr. Friedrich Förster; Professor Dr. Richard Zimmermann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 262799109

Frisch synthetisierte Proteine, deren Bestimmungsort Membranen, das Lumen von Organellen der endo- und exozytotischen Wege, oder der extrazelluläre Raum ist, müssen durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums transportiert oder in sie integriert werden. In Säugerzellen werden die meisten Proteine während der Translation durch zytosolische Ribosomen transloziert (kotranslational), während posttranslationale Translokation meist auf kleine präsekretorische Proteine, die für interzelluläre Kommunikations- und Regulationsvorgänge benötigt werden, beschränkt ist. In diesem Gemeinschaftsprojekt schlagen wir vor, die für ko- und posttranslationale Translokation sowie für posttranslationale Modifikationen von Polypeptiden zuständige Proteinmaschinerie in Säugerzellen bezüglich ihrer Zusammensetzung und Struktur, sowie der Funktion ihrer Komponenten zu charakterisieren. Um die Architektur und das Zusammenspiel der etwa 40 verschiedenen Untereinheiten der Maschinerie zu untersuchen, nutzen wir einen stark interdisziplinären Ansatz. Systematisches Stilllegen spezifischer Gene der Komponenten in humanen Zellen mittels siRNA in Kombination mit quantitativer Analyse des zellulären Proteoms mittels Massenspektrometrie (MS) werden zur Identifizierung und Charakterisierung ihrer Substrate genutzt. Detailliertere funktionelle Analyse der Komponenten ermöglichen Assays für die Translokation etablierter und neu identifizierter Substrate in humanen semi-permeabilisierten und intakten Zellen in Verbindung mit genetischer Veränderung dieser Komponenten durch siRNA und cDNA Komplementierung. Mittels Kryo-Elektronentomographie (KET) kombiniert mit Subtomogrammmittelung erhalten wir die dreidimensionale Dichte des nativen Kerns der nativen kotranslationalen Translokationsmachinerie (Kotranslokon). Einige Untereinheiten werden in dieser Dichte lokalisiert durch Vergleich mit Dichten in denen sie mittels siRNA entfernt sind oder mit funktionell inerten Markern fusioniert sind und andere anhand ihrer Kristallstrukturen. Rechnerische Modellierung bestimmt die wahrscheinlichste räumliche Anordnung der Untereinheiten auf der Basis obengenannter Daten, sowie mittels chemischer Vernetzung und MS erhaltener Informationen über die räumliche Nähe spezifischer Residuen. Subtomogrammklassifikation der Kotranslokon-Partikel klärt die verschiedenen Zustände der mit dem Kotranslokon dynamisch assoziierten Maschinerie auf. Schließlich nutzen wir KET, um auch posttranslationalen Import von Modellsubstraten und die strukturellen Unterschiede von Ko-und Posttranslokon zu visualisieren. Unsere publizierten und vorläufige Daten zeigen, dass der hier vorgeschlagene integrative Ansatz machbar ist. Die gewonnenen Erkenntnisse werden auch zu einem besseren Verständnis der Genese einer Reihe humaner Krankheiten, wie der polycystischen Lebererkrankung, Diabetes und verschiedenen Tumorerkrankungen beitragen und möglicherweise auch auf die Spur neuer therapeutischer Strategien führen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen