Lightsheet Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Lightsheet-Mikroskopie ermöglicht zeitlich gut aufgelöste Einzelzellmessungen über einen längeren Zeitraum (z.B. 24 Stunden) unter Inkubatorbedingungen in großen dreidimensionalen (3D) Volumina (z.B. 500µm x 500µm x 500µm) bei sehr geringem Bleichen von Fluoreszenzproteinen und Farbstoffen mit subzellulärer Auflösung. Nach der Inbetriebnahme des Lightsheet-Mikroskops haben wir ca. ein Jahr gebraucht, um alle Messbedingungen für Langzeitmessungen von 24 Stunden zu optimieren. Zu diesen Bedingungen zählen: 1) Optimierung einer 3-dimensionalen extrazellulären Matrix zur Untersuchung des Migrations- und Zytotoxizitätsverhaltens von verschiedenen primären menschlichen Immunzellen und Krebszellen; 2) Gewährleistung der Temperaturkonstanz von 37 Grad Celsius; 3) Vermeidung der Evaporation von Lösung bei den Messungen bei längeren Messungen von 37 Grad Celsius; 4) Konstanz von pH und Osmolarität bei Langzeitmessungen. Das Hauptproblem der Optimierung war die Konstanz der anderen Parameter bei 37 Grad Celsius; bei 22 Grad Celsius hatten wir von Anfang an praktisch keine Probleme. Da wir die menschlichen Zellen allerdings unbedingt bei 37 Grad Celsius analysieren wollten, haben wir solange verschiedene Bedingungen optimiert, bis wir zufriedenstellende Ergebnisse erhielten. Einen wichtigen Teil dieser Protokolle haben wir deswegen auch in einer eigenständigen Arbeit publiziert. Unsere Arbeitsgruppe ist sehr interessiert daran, mit welcher Effizienz menschliche zytotoxische T Zellen (ZTL) und Natürliche Killerzellen (NK) Krebszellen unter verschiedenen Bedingungen eliminieren. Um diese Effizienz zu quantifizieren, haben wir einen Assay etabliert, der die Effizienz von einzelnen menschlichen ZTL und NK Zellen über 24 Stunden und länger auf Einzelzellbasis quantifizieren kann. Dabei können Apoptose, Nekrose und Zwischenformen des Zelltodes einzelner Krebszellen induziert von ZTL und NK Zellen unterschieden werden. Ein wichtiges Kernstück dieser Publikation sind die Lightsheet Analysen in einer 3 dimensionalen Kollagenmatrix, wobei der Zelltod von Krebszellen induziert von menschlichen NK Zellen quantifiziert wurde. Hier haben wir sowohl den Zelltod von einzelnen Krebszellen induziert durch Kontakt mit NK Zellen analysiert als auch erste Messungen zu Tumorsphäroiden präsentiert. In einer noch nicht ganz fertiggestellten Doktorarbeit haben wir die Effizienz der Zytotoxizität verschiedener ZTL Subtypen analysiert. Interessanterweise unterscheiden sich ZTL und NK Zellen sehr stark bezüglich des Modus (Apotose, Nekrose, Mischformen) und in der Kinetik, mit denen sie Krebszellen umbringen. Des Weiteren haben wir das Lightsheet-Mikroskop systematisch dafür eingesetzt, um die Bewegung (Migration) von ZTL und NK Zellen in der 3 dimensionalen Matrix hinsichtlich Geschwindigkeit, Gradlinigkeit (Persistenz) und Pausenzeitenunter unter verschiedensten Bedingungen zu quantifizieren. Diese Daten wurden dann mit der Bewegung (Migration) auf „physiologischen“ Oberflächen verglichen. Die wesentlichen Daten zur Bewegung (Migration) in den 3 dimensionalen Matrizen wurden in der Doktorarbeit von Rouven Schoppmeyer erhoben. Von diesen Daten ist nur ein kleiner sehr spezieller Teil zum sogenannten Bystander-Effekt publiziert. In Zusammenarbeit mit Franziska Lautenschläger (INM, Saarbrücken) haben wir die Rolle von Aktin bei der Migration von Immunzellen analysiert. Die Lightsheet Mikroskopie wurde auch eingesetzt, um die Rolle des Zytoskelett-regulierenden Proteins Profilin-1 auf die Zytotoxizität von ZTL bei gesunden und an Krebs erkrankten Personen zu analysieren. In zwei weiteren Projekten haben wir die Rolle der Steifigkeit der 3-dimensionalen Kollagen-Matrix auf die Funktion von ZTL und NK Zellen bei der Eliminierung von Krebszellen sowie die Beeinflussung der Zytotoxizität von NK Zellen durch der Anwesenheit von CD4+ und CD8+ T-Zellen untersucht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 2017 Mar 13;7:44357
Zhou X, Zhao R, Schwarz K, Mangeat M, Schwarz EC, Hamed M, Bogeski I, Helms V, Rieger H, Qu B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/srep44357) - Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 2017 Sep;47(9):1562-1572
Schoppmeyer R, Zhao R, Cheng H, Hamed M, Liu C, Zhou X, Schwarz EC, Zhou Y, Knörck A, Schwär G, Ji S, Liu L, Long J, Helms V, Hoth M, Yu X, Qu B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/eji.201747124) - Light-sheet Microscopy for Threedimensional Visualization of Human Immune Cells. J Vis Exp. 2018 Jun 13;(136)
Schoppmeyer R, Zhao R, Hoth M, Qu B
(Siehe online unter https://doi.org/10.3791/57651) - Natural killer cells induce distinct modes of cancer cell death: Discrimination, quantification, and modulation of apoptosis, necrosis, and mixed forms. J Biol Chem. 2018 Oct 19;293(42):16348-16363
Backes CS, Friedmann KS, Mang S, Knörck A, Hoth M, Kummerow C
(Siehe online unter https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.004549)
