Development of conditional multi-shRNA constructs for anti-HIV-1 RNA-silencing
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Potential der RNAi für die Therapie ist eines der größten der letzten Jahrzehnte. Seit der Entdeckung des Mechanismus in Zellen höherer Organismen im Jahr 2001 durch Prof. Thomas Tuschl und seine Arbeitsgruppe wird die Technologie als Medizin der Zukunft gehandelt. Im Zuge meines Forschungsstipendiums habe ich mich mittels verschiedener Ansätze mit der antiretroviralen Anwendung von RNAi befasst. Zum einen wurden short hairpin RNAs (shRNAs) mit konservierten Zielen auf HIV-1 Transkripten in die Zelle eingebracht, um die Virusreplikation durch den RNAi Mechanismus zu unterbinden. Als erfolgreicher erwies sich die Anwendung antiviraler-miRNAs. Diese wurden in enger Anlehnung an existierende humane miRNA-Polycistrone designed und es war möglich, die Replikation des HI-Virus sehr effizient zu unterbinden. Von Vorteil gegenüber shRNAs war hierbei, das sich vier bis fünf miRNA-Vorläufer in einem einzelnen Transkript exprimieren lassen. Erwieterte Untersuchungen zur Anwendungssicherheit und möglichen Nebeneffekten durch partielle Bindung an Zielsequenzen wurde ausführlich untersucht. Innovativen Therapien mit modernen Technologien wie der RNAi mangelt es vor allem an einer zuverlässigen und sicheren Form des gewebespezifischen Wirkstofftransports (Directed Drug Delivery). Um die Anwendung der RNAi gegen HIV zu erweitern, bzw. zu ermöglichen haben wir uns einer jungen Technologie angenommen, die das Directed Drug Delivery ermöglicht. Abgeleitet von der Biologie der Viren benutzten wir ein rekombinant hergestelltes Kapsidprotein VP1 des humanen Polyoma JC Virus. VP1 besitzt die Eigenschaft, spontan kugelförmige, leere Kapside zu bilden, deren Lumen sich in einem leicht zu kontrollierenden Prozess beladen lassen. Die VLPs wurden mit antiretroviralen RNAi-Effektoren gefüllt, d.h. mit siRNAs gegen HIV oder dem o.g. miRNA-Polycistron. Zur Aufnahme in die Zellen wurden die beladenen VLPs mit einem Liganden konjugiert, der die Aufnahme in den T-Zellen ermöglicht. Infektionen mit HIV-1 konnten auf diesem Wege sowohl in humanen T-Zelllinien als auch in primären Zellen aus Humanblut vollständig unterbunden werden. Toxische Effekte wurden nicht beobachtet und eine parallel verlaufende Studie zur Immunogenität zeigte sehr vielversprechende Ergebnisse für eine zukünftige klinische Anwendung.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2009). RNAi-mediated inhibition of HIV-1 by targeting partially complementary viral sequences. Nucleic Acids Res 37, 6194-6204
Liu, Y. P., Gruber, J., Haasnoot, J., Konstantinova, P., and Berkhout, B.
