Struktur und Funktion von N- und O-glykosylierten Flagellenproteinen bei der Adhäsion und dem Gleiten in Chlamydomonas reinhardtii

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Hippler
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 256628857

In einer ersten Arbeit konnten wir zeigen, dass die N-Glykosylierung flagellärer Proteine wesentlich für die effiziente Adhäsion von C. reinhardtii Zellen an Oberflächen ist (Xu et al. 2020). In einem nächsten Schritt befassten wir uns mit der Funktion der N- und O-glykosylierten Flagellenproteine FMG1-B und FMG1-A bei der Adhäsion und beim Gleiten. Experimente, die mit einer Insertions- fmg1b und einer CRISPR/Cas9 fmg1a-fmg1b-Doppelmutante durchgeführt wurden, stehen im Widerspruch zur Annahme, dass FMG1-B allein für die Adhäsion und das Gleiten erforderlich ist (Shih et al. 2013). Unsere Daten zeigten vielmehr, dass die N- und O-glykosylierten Flagellenproteine FMG1-B und FMG1-A für eine effiziente Adhäsion, aber nicht für das Gleiten essentiell sind. Versuche mittels kryogener Elektronentomographie zeigten, dass der duale Knock-out von FMG1-A und FMG1-B zu einem Verlust der flagellaren Glykoproteindichte und zu einer diffus verbleibende Flagellenhülle führt. Dies deutet darauf hin, dass FMG1-B und FMG1-A tatsächlich stark an der Glykokalyx-Bildung beteiligt sind, was mit ihrer Bedeutung für das Anhaften von Zellen an Oberflächen übereinstimmt. Unser Ziel ist es nun, diese Arbeiten zu erweitern und über CRISPR/Cas9 in einem gemeinsamen cc125-genetischen Hintergrund, Einzel- und Doppel-Knock-out-Mutanten der Gene fmg1a und fmg1b zu generieren. Dies ist wichtig, um eine unabhängige und vergleichende Analyse der fmg1a und fmg1b Einzelmutanten sowie der Doppelmutante hinsichtlich Adhäsion, Gleitfähigkeit und anderer Phänotypen zu ermöglichen. Es ist zudem geplant, FMG1-B mit Wildtyp-spezifischem fmg1b sowie ortsgerichteten mutierten Versionen des Gens mit veränderten N- und O-glykosylierten Stellen zu exprimieren. Dies ermöglicht die Bestimmung der Bedeutung spezifischer N- und O-Glykosylierungen für die Adhäsion. Die Adhäsion wird durch TIRF-Mikroskopie unter Verwendung einer unabhängigen automatischen Erfassung analysiert. Darüber hinaus wird die TIRF-Mikroskopie zur Messung von IFT und Gleitgeschwindigkeiten eingesetzt. Adhäsionskräfte werden über Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Mikropipettenkraftmessungen gemessen. Um zu bestimmen, welche Flagellen-Membranproteine in Abwesenheit von FMG1-B und FMG1-A mit der Oberfläche in Kontakt stehen und die Gleitfähigkeit bieten, werden wir Flagellen-Glykoproteine identifizieren, die sich während der Mikrosphären-Translokation von der Membranoberfläche in einer fmg1a-fmg1b Doppelmutante ablösen, wie zuvor beschrieben von (Kamiya et al. 2018). Kandidatengene werden in einem WT- und fmg1a-fmg1b Doppelmutantenhintergrund ausgeschaltet und wie oben beschrieben analysiert. Darüber hinaus werden Flagellen von Glykoprotein-Mutanten durch kryogene Elektronentomographie strukturell sichtbar gemacht. Wir gehen davon aus, dass diese Arbeiten dazu beitragen den strukturellen und funktionellen Mechanismus der Adhäsion und des Gleitens in C. reinhardtii zu entschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen