Zusammensetzung, Struktur und Funktion des mRNA-Prozessierungfaktors Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor (CPSF)

• Antragsteller: Professor Dr. Elmar Wahle
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 250983620

Die 3'-Enden von eukaryotischen mRNAs entstehen in einer Prozessierungsreaktion, in der die Prä-mRNA zunächst durch eine endonukleolytische Spaltung verkürzt und dann das 5'-Spaltfragment polyadenyliert wird. Innerhalb eines großen Proteinkomplexes, der die Reaktion katalysiert, wird der heterooligomere cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF) als der zentrale Faktor betrachtet: CPSF ist an der Spaltung und der Polyadenylierung beteilig, er enthält das Enzym, das die RNA-Spaltung katalysiert, er erkennt das AAUAAA-Polyadenylierungssignal, und er verleiht der Poly(A)-Polymerase Spezifität für AAUAAA-haltige Substrat-RNAs. Die Zusammensetzung von CPSF und seine molekularen Interaktionen sind jedoch nur teilweise verstanden.Wir haben CPSF aus sechs Untereinheiten rekonstituiert. Der rekonstituierte Faktor ist aktiv in der mRNA-Polyadenylierung. Für diese Reaktion sind jedoch mindestens zwei Untereinheiten entbehrlich, die wahrscheinlich nur für die Spaltung der RNA nötig sind. Da die beiden anderen an der Polyadenylierungsreaktion beteiligten Proteine, die Poly(A)-Polymerase und das nukleäre Poly(A)-Bindungsprotein, in E. coli hergestellt werden können, steht nun eine vollständig rekonstituierte Reaktion für mechanistische Studien zur Verfügung.Die Zusammensetzung des minimalen in der Polyadenylierung aktiven CPSF soll hinsichtlich der Untereinheiten und ihrer Stöchiometrie bestimmt werden.Die RNA-Spezifität von CPSF und der Beitrag der einzelnen Untereinheiten zur RNA-Bindung sollen studiert werden. Dies betrifft sowohl das AAUAAA-Polyadenylierungssignal als auch weitere Sequenzen, die möglicherweise von CPSF erkannt werden.Die Interaktionen der CPSF-Untereinheiten untereinander und vor allem mit der Poly(A)-Polymerase sollen bestimmt werden. Wir werden untersuchen, ob die Wechselwirkung von CPSF mit der Poly(A)-Polymerase durch die Länge des Poly(A)-Schwanzes bestimmt wird, wie es in einem publizierten Modell zur Poly(A)-Schwanz-Längenkontrolle postuliert wird. Wir werden erforschen, wie CPSF die Aktivität der Poly(A)-Polymerase stimuliert und ob zwei andere Prozessierungsfaktoren, cleavage factor I (CF I) und cleavage stimulation factor (CstF), tatsächlich die Polyadenylierung in einem rekonstituierten System stimulieren können, wie es in einem weniger sauberen System gefunden wurde. CF I und CstF sind beide überproduziert und gereinigt worden.Symplekin und cleavage factor II sollen überexprimiert werden. Damit wäre der Satz an bekannten 3'-Prozessierungsfaktoren komplett, und eine Rekonstitution der Spaltungsreaktion aus überproduzierten und gereinigten Faktoren soll versucht werden. Falls dies nicht erfolgreich ist, werden wir versuchen, den (die) fehlenden Faktor(en) zu identifizieren.Schließlich werden wir mit Strukturbiologen zusammenarbeiten, um bei der Aufklärung der Struktur von CPSF durch Röntgenstrukturanalyse und Kryo-Elektronenmikroskopie behilflich zu sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen