Untersuchungen zur phagenbedingten Regulation der Genexpression in Cyanophagen-Cyanobakterien-Systemen

• Antragstellerin: Dr. Claudia Steglich
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 245857825

Der marine Cyanobakterienstamm Prochlorococcus MED4 kann vom Cyanophagen P-SSP7 infiziert werden und es konnte gezeigt werden, dass während der Phageninfektion wirtsspezifische Transkripte der RNase E erhöht sind (Lindell et al., 2007). RNase E unterliegt einer strikten negativen „Feedback-Regulation“, welche unter Standardwachstumsbedingungen dafür sorgt, dass das Enzym seine eigene mRNA im 5’-UTR schneidet und somit die Mengen an gebildetem Protein reguliert. In der ersten Förderperiode konnten wir zeigen, dass während der Phageninfektion eine um den 5’-UTR verkürzte mRNA des rne-Gens transkribiert wird, wodurch die „Feedback-Regulation“ ausgehebelt wird. Die präferentielle Nutzung des internen Promoter Pi führt wiederum zu einem Anstieg der RNase E-Proteinmengen. Gleichzeitig transkribiert der Phage lange asRNAs, die zur Bildung von extensiven Duplex-RNA-Komplexen führen und gemeinsam mit Polysomen-beladenen mRNAs vor RNase E-Prozessierung schützen. Im Gegensatz dazu ist das Transkriptom vom Wirt nur partiell mit asRNAs abgedeckt und somit dem RNase E-vermittelten Abbau frei zugänglich. Als Folge dessen werden die Wirts-RNAs zu kleineren Fragmenten und weiter zu Ribonukleotiden prozessiert. Diese werden dann zu Desoxynukleotiden reduziert und stehen als freier Pool an dNTPs zur Phagengenomreplikation zur Verfügung und stimulieren somit auch die Phagenreproduktion.Ziel der zweiten Förderperiode ist es, die molekularen Mechanismen, die zur Aktivierung der RNase E während der Phageninfektion führen, bis ins kleinste Detail zu verstehen. Obwohl wir zeigen konnten, dass die verkürzte Isoform der RNase E durch Umgehung der negativen „Feedback-Regulation“ während der Phageninfektion in größeren Mengen produziert wird, wissen wir bisher nicht, welche Faktoren zu einer bevorzugten Nutzung des internen Promotors Pi führen. Des Weiteren wollen wir die Struktureigenschaften und die molekularen Spaltbesonderheiten der Prochlorococcus RNase E-Isoformen näher untersuchen. Mit dem rekombinanten Protein durchgeführte Spaltexperimente legen nahe, dass in den meisten Fällen die Substraterkennung - ungleich als bei anderen Bakterien – nicht sensitiv in Bezug auf den Phosphorylierungsstatus der 5’-Enden ist. Sowohl Mono- als auch Triphosphatenden werden mit vergleichbarer Effizienz geschnitten und auch ein Austausch von Isoleucin mit Valin an Position 128 der rekombinanten Prochlorococcus-Isoform führte zu keiner Änderung der Enzymaktivität, gegensätzlich zu dem, was für das E. coli-Homolog beschrieben wurde (Callaghan et al., 2005). Darüber hinaus soll in einem alternativen Ansatz zum „Two-Hybrid-System“ nach potentiellen Proteininteraktionspartnern der Prochlorococcus RNase E gesucht werden. Obwohl elektronmikroskopische Aufnahmen nahelegen, dass – wie auch im E. coli-Homolog – RNase E mit der Membran assoziiert ist, blieb es bisher ungeklärt, ob RNase E in einem Degradosomen-ähnlichen Multiproteinkomplex organisiert ist oder als Einzelprotein fungiert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen