Mechanistische Untersuchungen zur Funktion der ribosomen-assoziierten Chaperone RAC und Ssb während der Expression von nonstop- und Polylysin-Proteinen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Sabine Karola Rospert
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 244586127

Ergebnisse des Projekts haben gezeigt, daß unfertige naszierende Polypeptidketten über einen bisher wenig untersuchten Mechanismus vom Ribosom entlassen werden können. Diese verfrühte Translationstermination tritt auf, wenn der Elongationsprozess blockiert ist, auch wenn die A-Stelle des Ribosoms ein Sense-Codon enthält. Die verfrühte Translationstermination ist daher während der Translation Polylysine-codierender Bereiche und in Abwesenheit der Ribosomen-assoziierten Chaperone Ssb und RAC, stark begünstigt. Im Gegensatz dazu, ist die verfrühte Translationstermination stark herabgesetzt, wenn die Konzentration des Translationsterminationsfaktors eRF3 niedrig ist, oder wenn Zellen das ribosomale Protein Asc1, das als Bindestelle für Ribosomen-interagierende Proteine und Kinasen dient, abwesend ist. Unsere Daten zeigen, daß die E3 Ubiquitinligase Hel2 in Asc1-abhängiger Weise mit Ribosomen interagiert und dann ribosomale Proteine in direkter Nähe von Asc1 ubiquitiniliert.Wir möchten den Mechanismus der verfrühten Translationstermination untermauern und zeigen wie Ssb/RAC die verfrühte Termination verhindert, während das Vorhandensein von Asc1/Hel2 eine Voraussetzung für verfrühte Termination ist. Im Model Hefe werden wir biochemische und zellbiologische Methoden, wie die Analyse von Blockierungs-Reportern, Assays zur Detektion von transienten Protein-Protein Wechselwirkungen, Ubiquitinilierungs-Assays, und Untersuchungen in einem in vitro Hefe-Translationssystem zur Aufklärung der Mechanismen der Translationsblockierung, der Beteiligung von Schlüsselfaktoren und des Schicksals von Blockierungsprodukten einsetzen. Wir werden Codons und Sequenzkontext, so wie Terminationsfaktormutanten identifizieren, die die verfrühte Translationstermination beeinflussen. Wir möchten klären, ob und wie die akkurate Termination durch den Ubiquitinilierungslevel ribosomaler Proteine beeinflußt wird, und ob die Ubiquitinilierung ribosomaler Proteine dynamisch und reversibel erfolgt. Wir werden experimentell testen, ob im Moment scheinbar unzusammenhängende Funktionen von Asc1, wie die Funktion in der der Ribosomenblockierung und die Funktion in der "Ribotoxic Stress Response" über die Asc1/Hel2-abhängige Ubiquitinilierung ribosomaler Proteinen in Zusammenhang stehen. In diesem Projektteil möchten wir Kinasen, die unter "Ribotoxic Stress" Bedingungen Asc1/Hel2-abhängig an Ribosomen rekrutieret werden identifizieren und charakterisieren.Die Kenntnis von schwer zu translatierenden Nukleotidsequenzen, Translationsfaktor-Defekten und Streß Bedingungen, die zu verfrühten Translationstermination führen, wird unser Verständnis darüber, wie die hohe Präzision der ribosomalen Translation aufrecht erhalten werden kann erweitern. Darüber hinaus werden die hier vorgeschlagenen Untersuchungen Einsichten in die Mechanismen gewähren, über die die ribosomale Translation eukaryontischer Zellen in die zelluläre Streß Antwort und Proteinqualitätskontrolle einbettet ist.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen