Gerichtete Evolution von bakteriellen Polysialyltransferasen für strukturelle Untersuchungen und ihre Verwendung für enzymatische Polysialylierungen von therapeutischen Proteinen

• Antragsteller: Dr. Lars Baumann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 243357277

Als Sialinsäuren werden zusammenfassend Zuckerbausteine bezeichnet, welche im weitesten Sinne als Abkömmlinge der Neuraminsäure betrachtet werden können. Der wohl wichtigste Vertreter ist die N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) und eine besondere Form dieses Zuckers stellt die Polysialinsäure (PSA) dar, ein langkettiges Homopolymer, welches sich fast ausschließlich als Konjugat mit dem neuronalen Marker NCAM findet. Seine Expression ist zeitlich auf die pränatale Entwicklungsphase begrenzt und wird im adulten Organismus nur nach peripheren Nervenverletzungen reaktiviert, um die Regeneration des geschädigten Gewebes zu beschleunigen. Einige neuroinvasive Pathogene im Laufe der Evolution perfekte Anpassungsstrategien entwickelt und bilden PSA-haltige Kapselstrukturen aus, um sich als körpereigen zu tarnen und so den Abwehrmechanismen des Wirtes zu entkommen.PSA wird in einem mehrstufigen Biosyntheseprozess gebildet und von Polysialyltransferasen auf das Zielmolekül übertragen. Trotz intensiver Bemühungen ist es bisher nicht gelungen die dreidimensionale Struktur von bakteriellen oder tierischen Polysialyltransferasen aufzuklären. Fortschritte auf diesem Gebiet würden interessante Einblicke in die Funktionsweise dieser außergewöhnlichen, prozessiv arbeitenden Enzyme bieten und Möglichkeiten eröffnen maßgeschneiderte Antibiotika zur Behandlung lebensbedrohlicher Infektionen, insbesondere der bakteriellen Hirnhautentzündung, zu entwickeln.In wegweisenden Studien konnte weiterhin gezeigt werden, dass die chemische Kopplung von PSA an Proteintherapeutika (z.B. Insulin und Asparaginase) deren Stabilität und die Verweildauer im Blutstrom erhöht. Aufgrund der Bioabbaubarkeit, der praktisch nicht vorhandenen Toxizität und des geringen immunogenen Potenzials stellt die Modifizierung mit PSA eine attraktive Alternative zur pharmazeutisch zugelassenen PEGylierung dar, deren Metabolismus und Ausscheidung noch nicht vollständig geklärt sind. Polysialyltransferasen bieten sich daher als in vitro Katalysatoren für die effiziente Herstellung von therapeutischen Protein-PSA Konjugaten an.Ziel des Projektes ist es die Stabilität und Aktivität von bakteriellen Polysialyltransferasen mittels gerichteter Evolution zu verbessern, und die dafür verantwortlichen Mutationen aufzudecken. Hierfür soll ein neuartiges Hochdurchsatz-Screening entwickelt werden, um potenzielle Kandidaten schnell und zuverlässig zu identifizieren, welche dann in ausreichender Menge exprimiert und aufgereinigt werden sollen und abschließend mittels NMR und Röntgenkristallanalyse untersucht werden. Im fortgeschnittenen Projektstadium werden diese Mutanten für die enzymatische PSAylierung von klinisch relevanten Proteinen, wie z.B. SDF-1 und verschiedenen Gerinnungsfaktoren, verwendet und optimiert. Die hergestellten Konjugate werden im Hinblick auf die PSA-Kettenlänge, ihre Polydispersität und Stabilität mit in vitro Methoden getestet, um pharmakokinetische Parameter abschätzen zu können.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Kanada
• Gastgeber: Professor Dr. Stephen G. Withers
• Beteiligte Person: Professorin Dr. Annette G. Beck-Sickinger