Molekulare Mechanismen der Aktivierung muskarinerger M1-, M3-, und M5-Rezeptoren durch das Membranpotential

• Antragsteller: Professor Dr. Andreas Rinne
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie ; Anatomie und Physiologie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 242929415

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind pharmakologisch wichtige Signalproteine der Zellmembran, die über extrazelluläre Liganden aktiviert werden. Neue Befunde zeigen, dass die Ligandenbindung und Aktivität einiger GPCRs vom Membranpotential abhängen. Der molekulare Mechanismus, über den GPCRs das Membranpotential detektieren, ist unbekannt. Das Forschungsverhaben untersucht, inwiefern die Aktivierungs- und Signaleigenschaften von muskarinergen M1-, M3-, und M5-Rezeptoren durch das Membranpotential reguliert werden. Dazu wird die Aktivität der Rezeptoren an lebenden Einzelzellen durch fluoreszenz-mikroskopische Verfahren unter gleichzeitiger elektrophysiologischer Kontrolle des Membranpotentials gemessen. Die spezifischen Forschungsziele sind: (1) Die Identifizierung von spannungssensitiven Rezeptorstrukturen. M1-Rezeptoren werden durch eine Depolarisation aktiviert, M3-Rezeptoren jedoch deaktiviert. Mit Hilfe von M1/M3-Rezeptor-Chimären sollen Strukturen identifiziert werden, die eine Spannungsabhängigkeit vermitteln. Die Liganden-induzierte Aktivität der Chimären wird bei definierten Membranpotentialen (Spannungsklemme) mit Hilfe eines optischen Biosensors für die Gq-Protein-Aktivität gemessen. Die Generierung der Chimären wird durch Molekulardynamik-Berechnungen unterstützt, die flexible Rezeptorstrukturen vorhersagen, welche im elektrischen Feld der Membran als Spannungssensoren fungieren können. (2) Die Analyse von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Hilfe des Membranpotentials. Eine Depolarisation der Membran deaktiviert M5-Rezeptoren, die Carbachol gebunden haben, aber aktiviert Pilocarpin-gebundene Rezeptoren. Diese verschiedenen intrinsischen Aktivitäten bei einer Depolarisation deuten auf Unterschiede im molekularen Bindeverhalten beider Agonisten hin. In den geplanten Experimenten werden Rezeptor-Biosensoren (M3-,M5-Rezeptor) verschiedenen Agonisten ausgesetzt und deren intrinsische Aktivität mit Hilfe von Depolarisationen der Membran analysiert. Ob Unterschiede, die in der Spannungsabhängigkeit gefunden werden, durch Liganden-spezifische Rezeptorkonformationen begründet sind, wird mit Hilfe von Dockingberechnungen, die die molekulare Interaktion der Liganden mit der Bindetasche der Rezeptoren vorhersagen, analysiert. (3) Die Spannungsabhängigkeit von Rezeptor-vermittelten Signalen. Viele Transkriptionswege werden durch Gq-Protein-vermittelte Signale kontrolliert. Da M1-Rezeptoren durch eine Depolarisation aktiviert werden, soll der Einfluss des Membranpotentials auf zelluläre Signale unterhalb des Gq-Proteins untersucht werden. Hierzu werden Zellen, die den M1-Rezeptor exprimieren, unter Zellkulturbedingungen längerfristig depolarisiert, und die Transkriptionsaktivität über spezifische Luziferase-Assays detektiert.Die Ergebnisse des Forschungsvorhabens werden helfen, den Mechanismus der Spannungsabhängigkeit von GPCRs weiter aufzuklären und zu neuen Einsichten in der molekularen Rezeptorpharmakologie führen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Beteiligte Person: Professor Dr. Peter Kolb