Elektrodenoptimierung für Neuroprothesen
Herstellung und Eigenschaften von Funktionsmaterialien
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Es konnte gezeigt werden, dass humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus dem Knochenmark eine hohe spenderspezifische Variabilität in der Expression von „neuronalen“ Genen aufweisen. Keine einzige Zellpopulation zeigte eine verstärkte Expression mehrerer derartiger Gene, womit sich die MSCs für den Einsatz im Projekt als besonders gut geeignet erwiesen. Wir nutzten mehrere experimentelle Ansätze, um humane MSCs zu Neuronen (iN) oder zu induzierten neuronalen Stammzellen (iNSC) zu reprogrammieren. Die Klonierung der drei humanen Faktoren Ascl1, Brn2 und Myt1l (Vierbuchen et al. arbeiteten mit den murinen Varianten) für die Reprogrammierung zu iN stellte sich sehr schwierig dar. Ursache hierfür waren Bereiche hochrepetitiver Nukleotidsequenzen, die zu Punktmutationen und Deletionen führten. Daher wurde eine alternative Strategie zur Erzeugung von iNSCs eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse waren hoch interessant; leider war jedoch die verfügbare Projektlaufzeit nicht mehr ausreichend, um bei diesem Ansatz weitere Experimente einschließlich funktioneller Studien durchführen zu können. Der Einsatz von ausgewählten Medien unterstützte die Differenzierungsprozesse. Hier konnte, wie erwartet, bisher kein Medium identifiziert werden, dessen alleiniger Einsatz eine langfristig stabile Differenzierung (in Bezug auf Morphologie, Gen-/Proteinexpression sowie funktionelle Parameter) von MSCs in mature Nervenzellen auslöst. Des Weiteren wurden verschiedene Protokolle etabliert, um mit Hilfe von small molecules elektrisch erregbare neuronale Zellen aus MSCs zu generieren. Die Analyse der Marker in diesen MSC-iNs zeigte, dass die entsprechenden Behandlungen der Zellen dafür sorgten, dass die Expression von MSC-Markern auf mRNA- und auf Proteinebene zunehmend unterdrückt wurde, während einige neuronale Marker hochreguliert wurden. Das ließ eine neuronale Differenzierung der MSCs vermuten. Während dieser Entwicklung veränderten die Zellen zudem ihre Kopplungseigenschaften. Die Kopplung über elektrische Synapsen wurde geringer. Es bleibt zu klären, ob das Zellnetzwerk an dieser Stelle durch neue chemische Synapsen erweitert wurde. Die Erregbarkeit der generierten Zellen zeigte sich in Patch-Clamp-Experimenten, in denen nicht-repetitive Aktionspotentiale ausgelöst werden konnten. Es kann zusammengefasst werden, dass wir mit Hilfe der genannten Protokolle in der Lage waren, die Zellen auf einer neuronalen Linie zu entwickeln, wobei die Reprogrammierung zu stabilen maturen Neuronen noch nicht möglich war. Auf der materialtechnischen Seite wurden zwei laserbasierte Prozessketten zur Herstellung polymerbasierter Nanokomposite etabliert, welche eine homogene, agglomeratfreie NP-Verteilung innerhalb der Polymermatrix ermöglicht. Die Probenmaterialien wurden reproduzierbar mittels Gießverfahren und Spritzguss für PDMS- bzw. TPU-basierte Probekörper mit additivierten NP aus Gold, Platin, Eisen, CNTs und Eisen-dekorierten CNTs als Dotierungselementen hergestellt. Die NP-Materialien waren biokompatibel. Eine Strukturierung der Materialoberfläche ließ sich reproduzierbar und präzise realisieren. Rillenstrukturen verbesserten die Orientierung der Zellen. Die Materialeigenschaften wie Härte und Elastizität wurde mittels Nanoindentation, sowie die Reißfestigkeit und Reißdehnung des Polymers mittels Zugversuchen untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Werkstoffeigenschaften mit bis zu 1 wt% NP-Anteil nicht beeinflusst werden. Oberhalb dieser Grenze nimmt die Sprödigkeit der Nanokomposite mit steigendem NP-Anteil tendenziell zu. Um eine gezielte lokale Leitfähigkeit zu erzeugen, wurde mittels magnetischen und elektrischen Feldern die gezielte Ausrichtung der NP verfolgt. Experimentelle Untersuchungen an ausgerichteten Eisen-NP-dekorierten CNTs mit insgesamt 1 wt% NP-Anteilen zeigten eine signifikant erhöhte elektrische Leitfähigkeit mit ca. 10^-4 S/m, die 6 Größenordnungen über dem Wert der nicht ausgerichteten Referenzproben liegt. Eine weitere Leitfähigkeitssteigerung von 5 Größenordnungen wurde durch Femtosekunden-Laserdirektschreiben von Silberionen in TPU erreicht. Somit ließen sich, mit den hier verwendeten Techniken, weiche Polymere mit verbesserten Leitfähigkeiten erzeugen, was für weitere Anwendungen im Bereich Neuroprothetik relevant ist.
