ERA-Chemistry: Neue Ansätze zur Oligonukleotid-gerichteten enzymatischen DNA-Methylierung

• Antragsteller: Professor Dr. Elmar Weinhold
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 234142899

Techniken zur gezielten DNA-Methylierung von ausgesuchten CpG-Sequenzen im Genom von Säugetieren und eine damit verbundene Stilllegung von Genen wären wertvolle Werkzeuge für die Analyse von epigenetischer Information und Untersuchung der Rolle von DNA-Methylierung bei Gesundheit und Krankheit. Eine Möglichkeit zur gerichteten DNA-Methylierung basiert auf die kovalente Verknüpfung einer DNA-(Cytosin-5)-Methyltransferase (MTase) mit einer Targetingdomäne, die mit hoher Spezifität an die DNA bindet und die DNA-MTase in der Nähe der adressierten CpG-Sequenz verankert. In den meisten Untersuchungen wurden bislang Zinkfingerproteine als Targetingdomänen eingesetzt aber Tripelhelix-bildende (forming) Oligonucleotide (TFO) und Peptidnukleinsäuren (PNA) stellen vielversprechende Alternativen dar. Bisher verwendete Methoden zur Kupplung der CG-spezifischen DNA-MTase M.SssI mit TFO waren jedoch unbefriedigend. Sie lieferten entweder eine ungenügende Ausbeute an TFO-MTase-Konjugat oder machten den Einsatz der wenig aktiven C141S-Mutante zum Schutz des Enzyms gegen Maleimid-Inaktivierung im Kupplungsschritt notwendig.In diesem Forschungsvorhaben möchten wir daher neue Strategien zur Kupplung von TFO und PNA mit vollaktiver M.SssI, die das katalytisch aktive Cys141 enthält, und der enzymatisch aktiven Domäne der menschlichen DNA-MTase Dnmt3a entwickeln. Im ersten Ansatz werden die DNA-MTasen mit dem SNAP-tag, einer modifizierten O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase, genetisch fusioniert und die Kupplung durch einen SNAP-tag-vermittelte enzymatischen Transfer der TFO/PNA auf die Fusionsproteine bewirkt. Beim zweiten Ansatz werden nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen einem Cystein-modifizierten His-tag genutzt, um eine an die TFO/PNA gebundene reaktive Gruppe in räumliche Nähe zum Cysteinrest zu bringen und so eine spezifische kovalente Bindungsbildung hervorzurufen. Anschließend soll die DNA-Methylierungsspezifität der TFO/PNA-MTase-Konjugate in vitro und in kultivierten menschlichen Zellen in vivo untersucht werden. Die vorgeschlagenen TFO/PNA-MTase-Konjugate könnten nützliche Werkzeuge für die genspezifische Untersuchung der epigenetischen Regulation sein und neue therapeutische Wege aufzeigen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Ungarn
• Partnerorganisation: OTKA Hungarian Scientific Research Fund
• Beteiligte Person: Professor Dr. Antal Kiss