Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Arbeitsgruppe Prof. Heilmann (Institut für Biochemie und Biotechnologie). Das Gerät ist das leistungsstärkste konfokale Mikroskop am MLU Campus. Durch die Nutzung des Gerätes war es möglich, Projekte durch qualitativ hochwertige konfokale Aufnahmen zu unterstützen. Mehrkanalfluoreszenzaufnahmen wurden in maßgeblichem Umfang in Untersuchungen zur Rolle von Phosphoinositiden bei der Steuerung von Entwicklungsprozessen in Pflanzen eingesetzt. Im Mittelpunkt dieser Arbeiten standen Untersuchungen zur Zellplattenbildung bei Arabidopsis thaliana, des Kernimportes von Phosphoinositid-Kinasen, der Kontrolle von Phosphoinositid-Kinasen durch Mitogen-assoziierte Proteinkinasen beim polaren Spitzenwachstum der Pollenschläuche, der PAMP-vermittelten Phosphorylierung der Arabidopsis PI4P 5-Knasen, der Rolle von Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate bei der Zellwandbildung in Arabidopsis thaliana und des Einflusses des Effektor- Proteins XopH aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) auf das pflanzliche Zytoskelett. Die Aufnahmen ermöglichten die subzelluläre Lokalisierung verschiedener Marker in unterschiedlichen pflanzlichen Zelltypen, den Nachweis spezifischer Protein-Protein Interaktionen durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation, sowie zeitlich aufgelöste Bildfolgen zur Darstellung dynamischer Plasmamembran-Prozesse, wie z.B. die stressinduzierte Assoziation fluoreszierender Reporter für Phosphoinositide mit der Plasmamembran. Arbeitsgruppe Prof. Klösgen (Institut für Biologie/Pflanzenphysiologie). Die vorgenommen Arbeiten konzentrierten sich insbesondere auf die Analyse von „dual targeting“ kerncodierter Proteinen der Mitochondrien und Plastiden. Die systematische Analyse des „dual targeting“- Phänomens, d.h. dem durch doppeldeutige Transitpeptide vermittelten Transport kerncodierter Proteine sowohl in Mitochondrien als auch in Plastiden, ergab, dass etwa 5% der kerncodierten Organellproteine dieses Transportverhalten zeigen. Davon scheint aber nur ein geringer Anteil auch tatsächlich Funktionen in beiden Organellen zu übernehmen. Vergleichende Analysen mit mitochondriellen Proteinen aus tierischen Zellen legen stattdessen nahe, dass es sich beim „dual targeting“-Phänomen um ein evolutionäres Relikt handelt, welches sich aus der konsekutiven Etablierung beider endosymbiontischer Zellorganellen erklärt. In einem weiteren Schwerpunkt konnten seit der Anschaffung des Gerätes die Untersuchung von Organell-Myosin-Interaktionen weiter vorangetrieben werden. In einer umfassenden Untersuchung zur subzellulären Lokalisierung aller in Arabidopsis codierten Myosine der Klasse XI konnten die Interaktionsdomänen-GFP-Fusionen einiger weniger Myosine überraschenderweise im Zellkern lokalisiert werden. Diese für Pflanzen noch völlig unbekannte Lokalisierung deckt sich mit neueren Berichten aus tierischen Zellen, in denen Mitglieder der zu den pflanzlichen Myosinen der Klasse XI homologen Klasse V in Zellkernen zusammen mit Aktin gefunden wurden. Arbeitsgruppe Prof. Bonas (Institute für Biologie/Pflanzengenetik). Die Arbeiten konzentrieren sich auf Analysen der subzellulären Lokalisierung bakterieller Effektorproteine in der Pflanzenzelle und des Einflusses von Effektoren auf die pflanzliche Zellstruktur. Weiterhin wurden umfangreiche in-planta Analysen von Protein-Protein-Interaktionen durchgeführt. Für die Analysen zur subzellulären Lokalisierung einer großen Anzahl von Effektoren wurden GFP-Fusionsproteine genutzt, die Agrobacterium-vermittelt in der Pflanzenzelle synthetisiert werden. Zur korrekten Bestimmung zellulärer Strukturen erfolgte in Pflanzenzellen eine gleichzeitige Expression von Effektor-Derivaten mit Fluoreszenzmarkierten Organell-Marker. Weiterhin wurden durch konfokale Mikroskopie auch Änderungen der Effektor-Lokalisierung durch funktionelle Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Effektoren untersucht werden. Für die Analysen von Protein-Protein-Interaktionen und die Bestimmung der in die Interaktion involvierten Bereiche, konnten erfolgreich bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation (BiFC) und Fluoreszenz- Resonanz-Energietransfer (FRET) eingesetzt werden. Arbeitsgruppe Prof. Reuter (Institut für Biologie/Entwicklungsgenetik). Der Arbeiten mit dem CLSM konzentriert sich auf immunozytologische Analysen der Chromatinregulation bei den Modellorganismen Drosophila, Arabidopsis und dem pathogenen Pilz Colletotrichum graminicola. Für Analysen der globalen Kontrolle von Histon-Modifikationen wird bei allen Objekten ein umfangreiches neues Mutantenmaterial für Histon-modifizierende Enzyme und andere Chromatinfaktoren eingesetzt. Die Arbeiten eröffneten neue Einsichten in Funktion konservierte und Art-spezifische epigenetischer Faktoren bei der Kontrolle heterochromatischer Chromatinzustände. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten besteht in immunozytologischen Analysen der entwicklungs- und zelltypspezifischen Chromatindifferenzierung. Viele Chromatinproteine zeigen während der Entwicklung eine signifikant unterschiedliche Verteilung im Chromatin. Für die Analysen werden neben spezifischen Antikörpern auch transgene Linien zur Expression von Fusionsproteinen unter endogener Promoter-Kontrolle genutzt. Weiterhin wurde durch FRAP Analysen die hohe Dynamik der Bindung von Chromatinproteinen im Heterochromatin beim pathogenen Pilz Colletotrichum graminicola untersucht.
Publications
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