Molekulare und biophysikalische Prinzipien der Assemblierung von Intermediärfilament-Proteinen

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professor Dr. Harald Herrmann; Professorin Dr. Sarah Köster
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 227073266

Intermediärfilamente (IF) bilden ein Filament-System des Zytoskeletts tierischer Zellen. Sie bestehen aus einer Gruppe gewebsspezifischer fibrillärer Proteine, die sich alle durch eine zentrale alpha-helikale Domäne von hochkonservierter Domänen-Organisation auszeichnen; diese Zentralhelix ist in der Lage, ein sogenanntes „Coiled Coil“ (CC) mit einem zweiten Molekül zu bilden. Trotz dieser Ähnlichkeit sind die Aminosäuresequenzen sowie die mechanischen Eigenschaften der einzelnen Filament-Typen sehr verschieden. Wir haben gezeigt, dass IF-Proteine einen völlig anderen Assembly-Weg einschlagen als die globulären Proteine Aktin und Tubulin. Dies beinhaltet die Bildung von parallelen CC, die anti-parallel, halb-überlappend zu tetrameren Komplexen zusammentreten. Acht Tetramere lagern sich sodann bei Erhöhung der Ionenkonzentration lateral zusammen und bilden ein Minifilament, auch als „Einheits-Längen-Filament“ (ULF) bezeichnet. Die weitere, longitudinale Assoziation von ULFs zu Filamenten ist durch Elektronenmikroskopie sowie in kinetischer Hinsicht durch mathematische Modellierung gut verstanden. Die molekularen und biophysikalischen Parameter dagegen, die für das Verständnis dieser Wechselwirkung notwendig sind, sind völlig unklar. Deshalb wollen wir mittels komplementärer biochemischer und biophysikalischer Methoden Einsicht in die Bildung dieser Filamente gewinnen. Im Prinzip kann man das Problem auf das Verständnis der longitudinalen Assoziation zweier ULFs reduzieren, da die Verlängerung von Filamenten, nachdem alle ULFs verbraucht sind, auf die gleiche Weise durch End-zu-End-„Fusion“ geschieht. Wir werden hochreine, rekombinante Proteine mit Fluoreszenz-Farbstoffen koppeln und in speziellen Mikrofluidik-Kammern mittels Fluoreszenz-(Kreuz)-Korrelations-Spektroskopie beobachten. Ausgehend von einer Vielzahl von Mutationen, die das Assembly auf verschiedenen Stufen blockieren, sowie mit Hilfe von Erkenntnissen, die die Strukturaufklärung des CC von Vimentin erbracht haben, werden wir Aminosäure-Änderungen vornehmen, um den Assembly-Prozess gezielt zu beeinflussen. Die mutierten Proteine werden mittels analytischer Ultrazentrifugation und Elektronenmikroskopie charakterisiert. Darauf aufbauend werden wir das saure Gliafaserpotein (GFAP) in entsprechender Weise in Bezug auf ein Ko-Assembly auch mit Vimentin untersuchen. Vimentin und GFAP werden zusammen in der Embryogenese in Astrozyten gefunden. In einer nächsten Stufe der Untersuchung der Filament- und Netzwerkbildung von IF-Proteinen werden wir eines der prominentesten IF-assoziierten Proteine, Desmoplakin, gebunden an strukturierte Oberflächen einsetzen. Wir erwarten, dass diese Untersuchungen völlig neue Erkenntnisse in den Mechanismus der Filament- und Netzwerkbildung von IF-Proteinen erbringen werden. Schließlich erwarten wir neue Erkenntnisse zur Funktion von auf Anhaftungsarealen immobilisierten IF-Binde-Proteinen als „topogene Keime“ für die Entstehung komplexer Netzwerke.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen