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Projekt
Ortspezifische Funktionalisierung von Nanobodies: Visualisierung und Aufnahme in lebende Zellen
Antragstellerinnen / Antragsteller
Professorin Dr. Maria Cristina Cardoso; Professor Dr. Christian Hackenberger; Professor Dr. Heinrich Leonhardt
Fachliche Zuordnung
Biologische und Biomimetische Chemie
Förderung
Förderung von 2012 bis 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 223438233
Das langfristige Ziel dieser wissenschaftlichen Kooperation ist die Entwicklung und Validierung neuer Methoden für die Visualisierung und Manipulation biochemischer Prozesse in lebenden Zellen, indem fluoreszente Proteine für die direkte Aufnahme in Zellen modifiziert werden. Hierbei finden zyklische zellpenetrierende Peptide Verwendung, welche für eine intrazelluläre Spaltung und Freisetzung der Proteinfracht im Zytosol und Nukleus der Zelle entwickelt werden. Für die intrazelluläre Bindung an Zielproteine verwenden wir Nanobodies, die spezifisch an GFP, an DNA-Replikationsprotein PCNA und HIV-Capsid-Proteine binden. Verschiedene Strategien für die ortsspezifische Modifikation von Proteinen werden angewandt, um fluoreszente Label und artifizielle zyklische zellpenetrierende Peptide zu konjugieren. Diese Strategien schließen Intein-Exprimierung, den Einbau unnatürlicher Aminosäuren durch Amber Suppression, neue chemoenzymatische Modifikationsansätze und bioorthogonale Reaktionen ein. Orthogonale Funktionalisierungsstrategien werden zunächst am Beispiel der GFP-bindenden Nanobodies optimiert. Modifizierte vs- nicht-modifizierte Nanobodies werden in vitro und in vivo gegenüber ihren intrazellulären Targets validiert. Die direkte Zellaufnahme modifizierter Nanobodies wird mit Hilfe konfokaler Mikroskopie untersucht. Physiologische Auswirkungen auf die Targetkomponenten einschließlich der Zerstörung von Protein-Interaktionen werden mittels automatisierter Bildanalyse quantifiziert. Diese Kollaboration kombiniert Expertise in der Entwicklung von Nanobodies, bioorthogonaler Chemie und Protein Semi-Synthese, zellulären Aufnahmemechanismen, Mikroskopie und Zellbiologie. Von diesem gemeinsamen Projekt wird die Entwicklung völlig neuartiger Werkzeuge für die Detektierung, Untersuchung und Manipulation von Antigenen in lebenden Zellen erwartet.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
