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Projekt
Peptidtemplat-gesteuerte Biokonjugation an Proteinen auf und in lebenden Zellen für Untersuchungen von GPCR-Transport und -Kreuzreaktivität
Antragstellerinnen / Antragsteller
Professorin Dr. Annette G. Beck-Sickinger; Professor Dr. Oliver Seitz
Fachliche Zuordnung
Biologische und Biomimetische Chemie
Biochemie
Biochemie
Förderung
Förderung von 2012 bis 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 223301960
Die Aktivität von G-Protein gekoppelten Rezeptoren hängt von ihrer Lokalisation in der Zelle, der Rezeptordichte und ihrer Mobilität in der Membran ab. Für einige Rezeptoren ist eine essentielle Dimerisierung bekannt, bei anderen wird sie vermutet oder es wurde eine veränderte Pharmakologie bei Heterodimerisierung beschrieben. Mit Hilfe von mikroskopischen Verfahren konnten wertvolle Erkenntnisse über die Funktion von GPCR in lebenden Zellen erzielt werden. Allerdings können die fluoreszierenden Gruppen, die am Rezeptor eingeführt werden müssen, abhängig von ihrer Größe die Funktion (Ligandenbindung, Export zur Zellmembran, Rezeptorinternalisierung) wesentlich beeinflussen. In der ersten Förderperiode gelang uns die Entwicklung einer Markierungsmethode von Transmembranrezeptoren, die nur kleine zusätzliche Peptidsegmente benötigt, mit hoher Spezifität auch in lebenden, eukaryontischen Zellen erfolgt und innerhalb von Minuten praktisch jede Art der kovalenten Modifizierung einführen lässt. Die so markierten Rezeptoren sind vollkommen aktiv in allen untersuchten Testsystemen, wie Ligandenbindung, Signaltransduktion und Internalisierung. Unsere Methode wurde bislang für extrazelluläre Rezeptorsegmente gezeigt. Im Verlängerungsantrag planen wir die Vorteile unserer Markierungsstrategie (geringe Grösse, hohe Flexibilität) beizubehalten und Verfahren zu entwickeln, die es ermöglichen i) intrazelluläre Proteine (Adiponektin-Rezeptor, Arrestinproteine, Regulatoren der G-protein-Signaltransduktion) zu markieren, ii) Multiplex-Reaktionen für Imaging-Verfahren einzusetzen, iii) Quantifizierung von Rezeptoren auf Zelloberflächen in lebenden Zellen zu etablieren (z. B. durch rolling cycle amplification nach Markierung der Rezeptoren mit PNA und anschließender Hybridisierung mit DNA) und iv) die Oligomerisierung von Rezeptoren zu kontrollieren und ihre pharmakologische Relevanz aufzuklären (durch Hybridisierung der PNA-markierten Rezeptoren mit DNA definierter Länge).Die Methoden, die in diesem gemeinsamen Projekt entwickelt werden, erlauben es uns, die Dynamik physiologisch wichtiger Rezeptoren zu charakterisieren, wie die der Y-, NPFF-, CRF und Ghrelin-Rezeptoren. Wir planen die Kreuzreaktivität dieser Rezeptoren zu untersuchen, die für Liganden zugängliche Rezeptordichte auf der Zelloberfläche zu quantifizieren und die Dynamik (durch FRET) und Zeitabhängigkeit (durch pulse-chase-Experimente) ihrer intrazellulären Wege und Interaktionspartner zu charakterisieren. Weiterhin planen wir das Konzept auf semi-synthetische Rezeptoren zu erweitern, wobei wir mit Hilfe von neuen Modifizierungsreagenzien lipidierte und pegylierte Rezeptoren generieren und somit den Einfluss unterschiedlicher Hydrophobizität auf die Signalkaskaden untersuchen können.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
