UHPLC- gekoppeltes Triple-Quadrupol Massenspektrometer
Final Report Abstract
Als Hauptrisikofaktor für die Brustkrebsentstehung gilt eine verlängerte Exposition gegenüber erhöhten Plasmaspiegeln des körpereigenen Steroidhormons 17β-Estradiol. Im Brustgewebe kann Estradiol (i) enzymatisch zu reaktiven elektrophilen Metaboliten aktiviert werden, die dann mit zytosolischem Glutathion (Entgiftung) und DNA reagieren, und (ii) durch Bindung an den Estrogenrezeptor alpha die Stimulation der Zellteilungsrate von Epithelzellen steigern. Die Bildung von DNA-Addukten und die Stimulation des Estrogenrezeptors begünstigen die frühe Phase der Brustkrebsentstehung (Initiation & Tumorpromotion). Die weibliche Brust ist heterogen aufgebaut und enthält Adipozyten-reiches Drüsengewebe sowie reines Fettgewebe. In beiden Gewebetypen werden spezifisch Enzyme exprimiert, die den Gewebespiegel an hormonell aktivem 17β-Estradiol kontrollieren können, das umfasst sowohl dessen Bildung als auch die Reduktion zu Estron, das eine deutlich schwächere Hormonantwort als das Estradiol auslöst, aber immer noch metabolisch aktiviert werden kann. Das Estron kann seinerseits zum Sulfat konjugiert werden, wodurch keine Rezeptorbindung mehr möglich ist und auch keine metabolische Aktivierung. Welche Reaktionen letztlich den Gewebespiegel in der Brustdrüse bestimmen, wird gegenwärtig kontrovers diskutiert. Unglücklicherweise werden als Diskussionsgrundlage Gewebespiegel verwendet, die entweder mit unspezifischen Immunoassays generiert wurden, oder aber es erfolgte eine mehr oder weniger berücksichtigte chemische/enzymatische Hydrolyse der Konjugate vor Bestimmung der Estrogene. Mittels beschafftem UHPLC gekoppelter Massenspektrometer (ULC-MS/MS) wurden deshalb Methoden entwickelt, die nach chromatographischer Trennung eine spezifische und quantitative Bestimmung von (i) konjugierten Estrogenen (Estradiol und Estron), (ii) Estradiol- und Estron-Glutathion-Addukten und deren enzymatische Abbauprodukte (Cysteine und N-Acetylcysteine als Biomarker für intrazelluläre Catecholbildung; Anzahl: 18) und (iii) Estradiol-/Estron-DNA-Addukten (Anzahl: 15) im Fett- und Adipozyten-reichen Drüsengewebe sowie Plasma ermöglicht. Alle für die Quantifizierung erforderlichen deuterierten Konjugate und Addukte - ob gekauft oder (bio-)chemisch hergestellt - wurden mittels ULC-MS/MS bezüglich (Isotopen-)Reinheit und übereinstimmendem Fragmentierungsmuster mit den nichtdeuterierten Analyten charakterisiert. Diese ULC-MS/MS Methoden wurden dann auf humanes Brustgewebe (separiert in Drüse- und Fettgewebe) und Plasma, sowie Brusttumore, normales Brustgewebe und Plasma von Ratten jeweils aus unterschiedlichen Interventionsstudien angewendet. Das α,β,γ,δ-ungesättigte Lakton Patulin ist ein in Früchten (v.a. Äpfel) und daraus hergestellten Produkten häufig vorkommendes Mykotoxin, das bekanntermaßen mutagen ist. In hohen Konzentrationen reagiert es mit mehreren Molekülen des intrazellulären Nukleophils Glutathion, und die daraus resultierende Depletion begünstigt die Bildung von oxidativem Stress und damit Mutationen. Patulin in Konzentrationen, die keine Glutathion Depletion auslösen, verursacht jedoch ebenfalls Mutationen, die nicht durch oxidativen Stress ausgelöst werden. Die technischen Möglichkeiten der beschafften ULC-MS/MS (Fullscan, Produktionenscan, multiple-reactionmonitoring Modus, enhanced Produktionenscan und MS3) ermöglichten es im zellfreien System den Reaktionsmechanismus von Patulin mit DNA Basen in An- und Abwesenheit von Glutathion aufzuklären und auch bei unterschiedlichsten Reaktionsbedingungen (verschiedene Konzentrationsverhältnisse der Reaktanten, Gegenwart von zytosolischer Glutathion-S-Transferase, die die Reaktion von Glutathion mit Elektrophilen beschleunigt) zu bestätigen. Patulin reagiert sehr schnell mit Glutathion. Das Reaktionsprodukt ist jedoch entgegen der weitläufigen Meinung immer noch reaktiv und es kommt zur Adduktbildung mit DNA Basen. Intramolekulare Kondensationsreaktionen führen zur Ausbildung von zyklischen Glutathion-Patulin-DNA-Addukten. Darüber hinaus wurde die Reaktivität von Patulin gegenüber allen vier DNA-Basen unter Bildung von (Glutathion-)Patulin-DNA-Basen-Addukten in Ab- und Anwesenheit von Glutathion beobachtet. Alle Addukte wurden massenspektroskopisch charakterisiert und können jetzt, nach erfolgter Optimierung der Isolierung der Addukte aus der DNA, für das Biomonitoring in komplexeren zellulären Systemen verwendet werden. Darüber hinaus wird die Gültigkeit des beobachteten Reaktionsmechanismus für weitere in Lebensmittel vorkommende α,β-ungesättigte Carbonyle überprüft.
Publications
- The mycotoxin patulin reacts with DNA bases with and without previous conjugation to GSH: implication for related α,β‑unsaturated carbonyl compounds? Arch Toxicol. 2014 Dec 24
Pfenning,C., Esch, H.L, Fliege, R., Lehmann, L.
(See online at https://doi.org/10.1007/s00204-014-1443-z)
