Protein-RNA und Protein-Protein Wechselwirkungen im Immunsystem von Prokaryoten

• Antragsteller: Professor Dr. Henning Urlaub
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 192503913

Moderne massenspektrometrische Methoden erlauben nicht nur die detaillierte, quantitative Analyse von Gesamt- oder Teilproteomen, sondern bieten auch vielfältige Möglichkeiten zur Untersuchung zellbiogischer und strukturbiologischer Fragestellungen. Im Bereich der Strukturbiologie liefern insbesondere Protein/Protein- und Protein/Ligand- Quervernetzungsexperimente relevante Informationen über die tertiäre und quaternäre Struktur von Proteinen bzw. Proteinkomplexen. In dem vorliegenden Antrag beabsichtigen wir dementsprechend, massenspektrometrische Methoden zu verwenden, um 1) die Struktur verschiedener CRISPR-Cas Protein/Protein-, Protein/RNA- und Protein- RNA/DNA-Komplexe nach chemischer oder UV-Licht-induzierter Quervernetzung zu untersuchen, und 2) quantitative Änderungen im Proteom von Prokaryoten nach Phageninvasion zu bestimmen.In der ersten Förderperiode der Forschergruppe FOR 1680 untersuchten wir Protein/RNAWechselwirkungen an einzelnen Proteinen. In einer zweiten Förderperiode wollen wir diese Untersuchungen ausweiten, um in aufgereinigten CRISPR-Cas-Komplexen eine möglichst hohe Zahl von intermolekularen Wechselwirkungen zu identifizieren. In Kombination mit hochaufgelösten Strukturen einzelner Komponenten dieser Komplexe können identifizierte Wechselwirkungen als Restriktionen verwendet werden, um realistische Strukturen der Gesamtkomplexe zu erarbeiten, die einen Rückschluss auf deren Funktionsweise ermöglichen. Ferner beabsichtigen wir, die von uns entwickelte Methodik der Protein/RNA- Quervernetzung durch UV-Licht und der massenspektrometrischen Identifizierung von Protein-RNA Konjugaten auf in vivo-Proben, d.h. auf intakte Bakterien und Archaebakterien anzuwenden und die Ergebnisse mit den quantitativen Proteomdaten von infizierten Prokaryoten in Beziehung zu setzen. Da in den entsprechenden prokaryotischen Systemen eine Aufnahme von Teilen des Phagengenoms in das Wirtsgenom stattfindet und die Proteine des CRISPR-Cas Systems hierbei eine entscheidende Rolle spielen, erhoffen wir uns, durch diese in vivo-Quervernetzungsexperimente insbesondere CRISPR-Cas-RNA(DNA) Wechselwirkungen "auf frischer Tat zu ertappen".

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1680: Unravelling the prokaryotic immune system