Funktionelle Analyse der CRISPR-Cas Systeme in Methanosarcina mazei strain Gö1

• Antragstellerin: Professorin Dr. Ruth Anne Schmitz-Streit
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 192503913

Methanosarcina mazei Stamm Gö1 weist zwei CRISPR-Cas Systeme auf, die als Subtyp I-B und Subtyp III-C klassifiziert wurden. Basierend auf den Ergebnissen der ersten Bewilligungsphase postulieren wir, dass die in vivo Aktivität der Endoribonuklease Cas6b-IB essentiell für die crRNA Biogenese von beiden Subtypen ist (TypI-B und TypIII-C), und dass die CRISPR Systeme in M. mazei unter normalen Wachstumsbedingungen generell reprimiert vorliegen. Diese Repression beruht möglicherweise auf einer Transkriptionsregulation der CRISPR-Loci durch einen Regulator und / oder auf einer post-transkriptionellen Regulation durch asRNAs. Im vorliegenden fortführenden Projekt sollen daher schwerpunktmäßig die folgenden Ziele bearbeitet werden: (i)Die in vivo Funktion der Cas6b Endoribonuklease beider Subtypen soll mittels genetischer und biochemischer Ansätze aufgeklärt werden; insbesondere soll der Frage nachgegangen werden, ob in vivo eine Überkreuz-Komplementation der beiden Cas6b Proteine vorliegt. Hierzu werden die Auswirkungen der jeweiligen Einzelmutation (delta-cas6b-IB; delta-cas6b-IIIC) auf die in vivo crRNA Biogenese der beiden CRISPR-Loci mittels Northern Blot und RNA-Seq Analysen charakterisiert. Darüber hinaus soll geklärt werden, ob es in vivo unter nativen Bedingungen zur Ausbildung von möglichen Cas6b-IB Proteinkomplexen kommt. Hierzu wird das cas-IB Operon oder um einzelne cas-Gene verkürzte Derivate zusätzlich in M. mazei exprimiert. Vorliegende Komplexe werden bezüglich ihrer Zusammensetzung charakterisiert, sowie die crRNA-Biogenese bei zusätzlicher Expression des cas-IB Operons oder verkürzter Derivate evaluiert. (ii) Die postulierte regulatorische Funktion des CRISPR-assoziierten DNA-Bindeproteins (MMM565) und der identifizierten antisense RNAs - asCas6 und asCas3 - auf die CRISPR-Aktivität in M. mazei soll durch biochemische und genetische Ansätze aufgeklärt werden. (iii) Die CRISPR-Loci verschiedener neu isolierter M. mazei Stämme (ca. 30) werden mittels bioinformatorischer Methoden daraufhin analysiert, ob neue Spacer inseriert wurden. Hierbei soll insbesondere auf Spacer geachtet werden, die von dem neu identifizierten M. mazei spezifischen Virus MSV stammen. Parallel sollen verschiedene M. mazei Stämme mit dem Virus infiziert werden und auftretende resistente Stämme auf potentielle Spacer-Aufnahme in den CRISPR-loci analysiert werden. Ziel beider Ansätze ist es, die PAM-Sequenzen für den Subtyp I-B in M. mazei zu identifizieren und Einblick in die Evolution des CRISPR Systems in M. mazei zu erhalten. (iv) Nach Identifizierung der PAM Sequenzen soll ein Plasmid-basierter synthetischer CRISPR-Array für funktionale Analysen des Subtyps I-B etabliert werden, um unter anderem die Leader Funktion genauer zu charakterisieren. Zusätzlich ist geplant, den Effekt von Protospacern auf die Stabilität von Plasmiden in M. mazei zu untersuchen, sowie ein CRISPRi Tool zum Gen-silencing in M. mazei zu entwickeln.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1680: Unravelling the prokaryotic immune system