Untersuchung der prokaryotischen Immunsysteme I-B und I-D in archaea

• Antragstellerin: Professorin Dr. Anita Marchfelder
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 192503913

In der vorherigen Förderperiode haben wir das CRISPR-Cas System Typ I-B von Haloferax volcanii eingehend untersucht. Wir haben die PAM Sequenzen für Haloferax identifiziert, und konnten damit die PAM Sequenzen für das zweite Archaeon überhaupt erst bestimmen. Weiterhin konnten wir zeigen, dass das I-B System eine Seed-Sequenz für die Interaktion der Angreifer-DNA mit der crRNA benötigt, ähnlich wie es bei dem System I-E von E. coli beobachtet wurde. Außerdem konnten wir nachweisen, dass das I-B System einen Cascade-ähnlichen Komplex hat mit den zentralen Untereinheiten Cas5, Cas7 und der crRNA. Zusammengefasst konnten wir die Kenntnis über das bis dahin relativ unbekannte I-B System mit diesen neuen Daten erweitern. In der nächsten Antragsperiode wollen wir die Charakterisierung des I-B Systems komplettieren. Die Untersuchungen sollen weiterhin in Haloferax durchgeführt werden, da dieses Archaeon den Vorteil hat, dass sehr viele genetische Techniken angewandt werden können. Wir werden das Adaptations-Modul untersuchen und ein CRISPRi-Werkzeug für Archaeen entwickeln. Mit einem synthetischen CRISPR-Lokus wollen wir die Voraussetzungen für eine effiziente CRISPR RNA Prozessierung identifizieren. Um die essentiellen Charakteristika einer funktionellen crRNA zu bestimmen, werden wir einen in vivo crRNA-Prozessierungsweg der unabhängig von der Cas6 Prozessierung ist entwickeln. Außerdem werden wir die Protein-Protein und die Protein-RNA Interaktionen im Cascade-Komplex im Detail untersuchen. Der zweite Schwerpunkt in den nächsten drei Jahren liegt auf der Untersuchung des Systems I-D. Über dieses System ist bisher gar nichts bekannt, und wir wollen es in Thermofilum pendens und Halorubrum lacusprofundi untersuchen, um in vitro und in vivo Untersuchungen durchführen zu können. Die Gene für die Expression der Proteine in E. coli werden wir aus T. pendens nehmen, da Vorarbeiten gezeigt haben, dass man von Genen aus diesem Organismus gut rekombinante Proteine herstellen kann. Mit den rekombinanten Proteinen werden dann biochemische Experimente (Bindung an crRNA, Prozessierung der CRISPR-RNA) durchgeführt und strukturelle Studien (der einzelnen Protein und des I-D Cascade Komplexes). Für die in vivo Studien werden wir H. lacusprofundi benutzen. Wir werden die einzelnen Gene des I-D Systems deletieren und die Mutantenstämme auf ihre Fähigkeit crRNAs zu produzieren und in der Interferenz aktiv zu sein untersuchen. Aus Umwelt- Proben von Habitaten, an denen Halorubrum gefunden wurde und wächst, wollen wir Viren isolieren, um den Adaptationsprozess im Halorubrum I-D System untersuchen zu können. Zusammengefasst sollen diese Ansätze helfen, die molekularen Details des I-D System zu identifizieren und mit dem I-B System zu vergleichen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1680: Unravelling the prokaryotic immune system