Der Einfluss von Cap-Methylierungen auf die Erkennung durch Immunrezeptoren und Komponenten der Translationsmaschinerie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Rezeptoren des angeborenen Immunsystems erkennen konservierte Strukturen von Krankheitserregern, so genannte pathogenassoziierte molekulare Muster (engl. PAMPS). Der Nachweis von PAMPS führt zur Einleitung von Abwehrmechanismen gegen eindringende Mikroorganismen. Da Viren die zelluläre Biosynthesemaschinerie zur Replikation nutzen, produzieren sie fast keine ungewöhnlichen Strukturen, die als fremd erkannt werden könnten. Die angeborene Immunantwort gegen Viren besteht daher aus Rezeptoren, die virale Nukleinsäuren erkennen und immunaktivierende Alarmsignale erzeugen, sowie aus Nukleinsäure-bindenden Effektorproteinen, die die Integrität oder Funktion der viralen RNA oder DNA beeinträchtigen. Endogene Die RNA von Viren mit RNA-Genom unterscheidet sich von der endogenen RNA durch eine untypische Struktur, z. B. lange basengepaarte Regionen und fehlende Modifikationen wie Methylierung und Cap-Strukturen, die normalerweise bei endogenen RNAs vorhanden sind. Daher vermuten wir, dass sowohl RNA-Rezeptoren als auch Effektorproteine ähnliche Strukturen erkennen und angreifen. Cap0-mRNA ist durch ein 5'-5'triphosphatverknüpftes N7-methyliertes Guanosin (m7G) gekennzeichnet. In höheren Eukaryonten methyliert die Methyltransferase CMTR1 zusätzlich die 2'O-Position des vorletzten mRNA-Nukleotids(N1) (cap1-mRNA). Während das m7G-Cap für den mRNA-Export und die Initiierung der Translation durch den eIF4F-Komplex essentiell ist, verhindert die N1-2'O-Methylierung die Erkennung der cap1-mRNA durch die antiviralen RNA-Rezeptoren RIG-I und IFIT1 aber eine Funktion, die über die Immuntoleranz hinausgeht, war bisher nicht bekannt. Wir haben CMTR1-Knockout-Zellen (CMTR1-/-) erzeugt und festgestellt, dass die Behandlung mit Typ-I-Interferon (IFN-I) zu einer IFIT1-vermittelten Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen und einer breiten mRNA-Translation führt. Folglich zeigte die Stimulierung des antiviralen Rezeptors RIG-I in CMTR1-/--Zellen eine IFIT1-abhängige drastische Verringerung der IFN-I- und Chemokin- Protein-Induktion, was die Bedeutung der N1-2'O-Methylierung für antivirale Reaktionen belegt. Darüber hinaus wurden auch IFN-I- und IFIT1-unabhängige Effekte beobachtet: CMTR1-/-- Zellen waren kleiner, teilten sich langsamer und wiesen eine reduzierte Transkription von mRNAs auf, die ribosomale Proteine (RP), 5`TOP-RNA und snoRNA-Wirtsgene (SNHG) kodieren. Darüber hinaus zeigten Proteom- und Transkriptomanalysen, dass die Expression von NVL2, einem essentiellen Faktor in der Ribosomenbiogenese, durch ein alternatives Spleißereignis von NVL2 mRNA in CMTR1-/- Zellen stark unterdrückt wird. Diese Reduktion konnte nur durch katalytisch aktives CMTR1 wieder hergestellt werden. Insgesamt hat die N1-2'O- Methylierung durch CMTR1 neben der antiviralen Immunität weitreichende Auswirkungen auf die zelluläre Physiologie und steuert das Spleißen von NVL2. Beim Screening der Auswirkungen von 5'-RNA-Modifikationen auf die Erkennung verschiedener RNA-Rezeptoren entdeckten wir, dass 5'p-Termini die RIG-I-Aktivierung verhinderten, während 5'unmodifizierte Hydroxyl(OH)-dsRNA eine Restaktivierung zeigte. Die Analyse von RIG-I/dsRNA-Ko-Kristallstrukturen und Studien zur Aktivierung von Mutanten ergaben, dass das evolutionär konservierte I875 in der C-terminalen Bindungsdomäne von RIG-I die 5'pdsRNA-Bindung sterisch hemmt. Die Mutante RIG-I(I875A) wurde sowohl durch synthetische 5'p-dsRNA als auch durch endogene lange dsRNA innerhalb der polyA-reichen Fraktion der gesamten zellulären RNA aktiviert. RIG-I(I875A) interagierte spezifisch mit langer mitochondrialer RNA, und mit der Entfernung von mitochondrialer RNA aus der Gesamt-RNA verschwand auch die RIG-I stimulierende Aktivität. Insgesamt zeigt unsere Studie, dass die Vermeidung von 5'p-RNA-Erkennung entscheidend ist, um eine durch mtRNA ausgelöste RIG-I- vermittelte Autoinflammation zu verhindern.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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A conserved isoleucine in the binding pocket of RIG-I controls immune tolerance to mitochondrial RNA. Nucleic Acids Research, 51(21), 11893-11910.
de Regt, Ann Kristin; Anand, Kanchan; Ciupka, Katrin; Bender, Felix; Gatterdam, Karl; Putschli, Bastian; Fusshöller, David; Hilbig, Daniel; Kirchhoff, Alexander; Hunkler, Charlotte; Wolter, Steven; Grünewald, Agathe; Wallerath, Christina; Schuberth-Wagner, Christine; Ludwig, Janos; Paeschke, Katrin; Bartok, Eva; Hagelueken, Gregor; Hartmann, Gunther; ... & Schlee, Martin
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mRNA N1-2’O-methylation by CMTR1 affects NVL2 mRNA splicing. (2023, 9, 29). Wallstein Verlag.
Wolter, Steven; Hennig, Thomas; Wallerath, Christina; Schlee-Guimaraes, Thais M.; Kirchhoff, Alexander; Urban, Christian; Piras, Antonio; Stukalov, Alexey; Juranek, Stefan; Engelke, Michael; Boehm, Volker; Gehring, Niels H.; Hartmann, Gunther; Pichlmair, Andreas; Friedel, Caroline C.; Dölken, Lars & Schlee, Martin
