Insertion von Kernporen und dem Spindelpolkörper in die Kernmembran der Hefe.

• Antragsteller: Professor Dr. Elmar Schiebel
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 202157009

Im Rahmen dieses Projektes untersuchen wir wie große Proteinkomplexe in die Doppelmembran der Kernhülle inseriert werden. Dazu nutzen wir als Modelsysteme den Kernporenkomplex (NPC) und den Spindelpolkörper (SPB; Zentrosom) in der Bäcker- und Spalthefe. Neuste Erkenntnisse auf diesem Gebiet zeigen auf, dass sich der NPC in der Interphase ausgehend von der Kernseite der Kernhülle ausbildet. Nucleoporine reichern sich unterhalb der inneren Kernmembran (INM) an und deformieren diese Membran bis die INM mit der äußere Kernmembran (ONM) fusioniert. Wir konnten kürzlich zeigen, dass in der Bäckerhefe die Paralogen Brr6 and Brl1 Komponenten von NPC-Assemblierungsstellen sind und vielleicht sogar die Fusion der INM/ONM während der NPC-Biogenese bewirken. Ausgehend von diesen beiden Proteinen werden wir die Assemblierung der NPCs in der Kernhülle untersuchen. Methodisch werden wir Brr6/Brl1 der Bäckerhefe mittels genetischer und biochemischer Methoden analysieren. Insbesondere die Analyse von Proteo-Liposomen, die in Gegenwart von gereinigten Brr6 und Brl1 Proteinen rekonstruiert wurden, wird neue Erkenntnisse über die Aktivitäten der beiden Proteine liefern. Lokale Lipidveränderungen werden mit Hilfe von Lipidsensoren bestimmt. So können wir feststellen, ob Brr6 und Brl1 die Lipidzusammensetzung der Kernhülle während der NPC Biogenese beeinflussen. Unsere Daten sprechen zudem dafür, dass die Kernhüllen-Insertion des SPBs der Backhefe die Hilfe von NPCs benötigt. NPCs binden an den Tochter-SPB (dSPB), der sich zuerst auf der zytoplasmatischen Seite der ONM ausbildet. Diese NPCs stellen entweder die ONM/INM-Fusionsstelle zur Verfügung in welche der dSPB inseriert wird, oder sie liefern dem dSPB Proteine (z.B. Ndc1), die wichtig sind für die Insertion. Wir werden die SPB Duplikation mittels Elektronentomographie untersuchen, um die Interaktion des dSPB und der assoziierten NPCs besser zu verstehen. Hochauflösende Mikroskopie an lebenden Zellen wird zeigen, was mit den NPCs am dSPB während dessen Kernhüllen-Insertion passiert. Weiterhin werden wir die NPC/SPB Biogenese der Backhefe mit der der Spalthefe vergleichen. Überraschenderweise hat das Spalthefe SpBrr6 (Spalthefe hat kein BRL1), im Unterschied zum Bäckerhefe Brr6/Brl1, eine Funktion bei der Kernhüllen-Insertion des SPBs. Bisher ist jedoch unklar ob SpBrr6 eine Funktion bei der Assemblierung von NPCs hat. Wir werden untersuchen, ob diese NPC-Biogenesefunktion von SpBrr6 konserviert ist. Immunelektronenmikroskopie soll die Lokalisation von SpBrr6 aufzeigen und die Analyse von konditional letalen brr6(ts) Zellen wird die Funktion von SpBrr6 bei der Insertion des SPBs in die Kernhülle und der Biogenese von NPCs verdeutlichen. Zusammengefasst, kann gesagt werden, dass dieses Projekt zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Insertion des SPBs/NPCs in die Kernhülle entscheidend beitragen wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen