Regulation und Enzymologie apoptotischer Nukleasen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Unspezifische Nukleasen kommen ubiquitär in allen Reichen des Lebens vor, wo sie extrazellulär (oft sezerniert) nutritive (Serratia marcescens, Anabaena sp.) oder defensive (Streptococcus pneumoniae) Funktionen haben, oder intrazellulär, wo sie regulatorische Aufgaben im weitesten Sinne wahrnehmen. Wir haben im Rahmen eines DFG‐Projekts extrazelluläre bakterielle Nukleasen untersucht, deren katalytischen Mechanismus aufgeklärt und uns maßgeblich an ihrer Strukturaufklärung beteiligt. Eines dieser Enzyme (Serratia Nuklease) haben wir für ihre Anwendung beim Downstream‐Processing von rekombinanten Proteinen optimiert. Ein anderes Enzym (Streptococcus pneumoniae Nuklease EndA), spielt als Pathogenitätsfaktor eine große Rolle, weil es die angeborene Immunabwehr ausschaltet. Auf Grund unserer strukturellen und mechanistischen Untersuchungen ergibt sich die Perspektive, niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, um EndA zu inaktivieren und damit Streptokokken‐Infektionen zurückzudrängen. In einem weiteren DFG‐Projekt haben wie uns mit apoptotischen Nukleasen, insbes. mit der Caspase aktivierten DNase (CAD) und der Nuklease EndoG befasst. Im Vordergrund unseres Interesses stand die Frage nach dem Katalysemechanismus und der Regulation dieser Nukleasen. Während die Katalysemechanismen bei beiden Enzymen sehr ähnlich sind (die beiden Enzyme gehören der Serratia Nuklease Familie an), kommen zwei unterschiedliche Strategien bei der Regulation zum Einsatz. CAD wird durch einen spezifischen Inhibitor gehemmt, der auch als Faltungshelfer fungiert und die Translokation in den Kern unterstützt, EndoG liegt im Intermembranraum des Mitochondriums kompartimentiert vor. Beide Nukleasen werden erst im Zuge der Apoptose freigesetzt, aus dem Komplex mit dem Inhibitor (CAD) bzw. aus dem mitochondrialen Kompartiment (EndoG). Unerwartet und erfreulich für uns war, dass sich herausstellte, dass CAD zu der Familie der ββα‐Me‐Finger Nukleasen (Serratia Nuklease Familie) gehört, die wir bereits seit 1990 ausgiebig untersucht und deren Katalysemechanismus wir aufgeklärt hatten. Überraschend für uns war, dass der CAD‐ICAD‐Komplex mit Chromatin assoziiert ist und dort im Zuge der Apoptose aktiviert wird. Erfreulich war ebenso die Identifizierung und erstmalige molekulare Charakterisierung einer zur Endonuklease G paralogen Exonuklease (EXOG), die vermutlich an der mitochondrialen DNA‐ Reparatur beteiligt ist. Bemerkenswert war, dass man eine durch Aminosäureaustausch inaktivierte Nuklease (EndA His160 → Ala) durch Supplementierung des Puffers in vitro bzw. des Mediums in vivo mit Imidazol reaktivieren kann.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Involvement of conserved histidine, lysine and tyrosine residues in the mechanism of DNA cleavage by the caspase‐3 activated DNase CAD. Nucleic Acids Res. 2002 Mar 15;30(6):1325‐32
Korn C, Scholz SR, Gimadutdinow O, Pingoud A, Meiss G
- The effect of ICAD‐S on the formation and intracellular distribution of a nucleolytically active caspase‐activated DNase. Nucleic Acids Res. 2002 Jul 15;30(14):3045‐51
Scholz SR, Korn C, Gimadutdinow O, Knoblauch M, Pingoud A, Meiss G
- The nuclease A inhibitor represents a new variation of the rare PR‐1 fold. J Mol Biol. 2002 Jul 19;320(4):771‐82
Kirby TW, Mueller GA, DeRose EF, Lebetkin MS, Meiss G, Pingoud A, London RE
- Experimental evidence for a beta beta alpha‐Me‐finger nuclease motif to represent the active site of the caspase‐activated DNase. Biochemistry. 2003 Aug 12;42(31):9288‐94
Scholz SR, Korn C, Bujnicki JM, Gimadutdinow O, Pingoud A, Meiss G
- Structural and functional characterization of mitochondrial EndoG, a sugar non‐specific nuclease which plays an important role during apoptosis. J Mol Biol. 2004 Apr 23;338(2):217‐28
Schäfer P, Scholz SR, Gimadutdinow O, Cymerman IA, Bujnicki JM, Ruiz‐Carrillo A, Pingoud A, Meiss G
- DNase II is a member of the phospholipase D superfamily. Bioinformatics. 2005 Nov 1;21(21):3959‐62
Cymerman IA, Meiss G, Bujnicki JM
- Interaction of DNA fragmentation factor (DFF) with DNA reveals an unprecedented mechanism for nuclease inhibition and suggests that DFF can be activated in a DNA‐bound state. J Biol Chem. 2005 Feb 18;280(7):6005‐15
Korn C, Scholz SR, Gimadutdinow O, Lurz R, Pingoud A, Meiss G
- Structural basis for stable DNA complex formation by the caspase‐activated DNase. J Biol Chem. 2005 Dec 16;280(50):41707‐15
Reh S, Korn C, Gimadutdinow O, Meiss G
- Structural insights into the mechanism of nuclease A, a beta beta alpha metal nuclease from Anabaena. J Biol Chem. 2005 Jul 29;280(30):27990‐7
Ghosh M, Meiss G, Pingoud A, London RE, Pedersen LC
- Human lysosomal DNase IIalpha contains two requisite PLD‐signature (HxK) motifs: evidence for a pseudodimeric structure of the active enzyme species. Protein Sci. 2007 Jan;16(1):82‐91
Schäfer P, Cymerman IA, Bujnicki JM, Meiss G
- The nuclease A‐inhibitor complex is characterized by a novel metal ion bridge. J Biol Chem. 2007 Feb 23;282(8):5682‐90
Ghosh M, Meiss G, Pingoud AM, London RE, Pedersen LC
- EXOG, a novel paralog of Endonuclease G in higher eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2008 Mar;36(4):1369‐79
Cymerman IA, Chung I, Beckmann BM, Bujnicki JM, Meiss G
- Endonucleases induced TRAIL‐insensitive apoptosis in ovarian carcinoma cells. Exp Cell Res. 2009 Sep 10;315(15):2487‐95
Geel TM, Meiss G, van der Gun BT, Kroesen BJ, de Leij LF, Zaremba M, Silanskas A, Kokkinidis M, Pingoud A, Ruiters MH, McLaughlin PM, Rots MG
- Mutational and biochemical analysis of the DNA‐entry nuclease EndA from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Res. 2010 Sep 15. [Epub ahead of print]
Midon M, Schäfer P, Pingoud A, Ghosh M, Moon AF, Cuneo MJ, London RE, Meiss G
- Production and characterization of recombinant protein preparations of Endonuclease G‐ homologs from yeast, C. elegans and humans. Protein Expr Purif. 2010 Sep;73(1):99‐106
Kieper J, Lauber C, Gimadutdinow O, Urbańska A, Cymerman I, Ghosh M, Szczesny B, Meiss G
