Mechanismen der enzymatischen Polyisoprenspaltung durch Rubber Oxygenase RoxA und durch Latex Clearing Protein LCP

• Antragsteller: Professor Dr. Dieter Jendrossek
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 194272362

Die Mechanismen der enzymatischen Spaltung von poly(cis-1,4-isopren) (Kautschuk) durch die Dihäm-Dioxygenase RoxA (rubber oxygenase) aus Xanthomonas sp. und durch das Latex-clearing-protein (Lcp) aus Streptomyces sp. sollen vergleichend untersucht werden. Bei Lcp handelt es sich um ein nicht-Hämprotein ohne Sequenzhomologie zur RoxA aber mit vergleichbarer Funktion: Zwei Ziele sollen verfolgt werden: (i) die bereits laufenden Untersuchungen zu RoxA werden durch gerichtete Mutagenesestudien (basierend auf der 1.8Å RoxA Struktur) und Bestimmung biochemischer und biophysikalischer Parameter (Aktivität, Produktzusammensetzung, UVvis- und EPR-Spektren) fortgesetzt. Insbesondere sollen die Beiträge einzelner Aminosäuren für die Sauerstoffbindung an das aktive Hämzentrum sowie die Reste bestimmt werden, die den Substratkanal bzw. die Substratbindestelle ausmachen und für die Bildung und Längenmessung des definierten C15-Spaltproduktes verantwortlich sind ("molecular ruler"). (ii) Die biochemische Analyse von Lcp war in der Vergangenheit durch das Fehlen eines funktionierenden Expressionssystems für Lcp aus dem WT oder rekombinanten Spezies nicht möglich. Kürzlich gelang es uns, Lcp aus Streptomyces sp. in aktiver Form über unser delta-roxA Xanthomonas sp. Expressionssystem in hoher Ausbeute zu expremieren. Wir werden Lcp reinigen, die Kautschukabbauprodukte identifizieren und das Vorhandensein von Metallatomen qualitativ und quantitativ bestimmen (oder Lcp als neues Mitglied der Gruppe Cofaktor-unabhängiger Oxygenasen klassifizieren). Es soll eine umfassende biochemische, biophysikalische und strukturelle Charakterisierung von Lcp erfolgen mit dem Ziel, die mechanistischen Übereinstimmungen und Unterschiede der enzymatischen Polyisoprenspaltung von RoxA und Lcp zu erkennen. Die gemeinsame Untersuchung von RoxA und Lcp eröffnet die einzigartige Möglichkeit, zwei neue (verschiedene) Enzymtypen bei gleicher biochemischer Funktion vergleichend mechanistisch zu untersuchen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen