Metabolische Kontrollanalyse der mikrobiellen L-Tryptophanproduktion im Zulaufverfahren

• Antragsteller: Professor Dr. Georg Sprenger; Professor Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 191572767

Mikrobielle Produktionsprozesse sind regulatorischen Mechanismen auf zellulärer Ebene unterworfen. Diese bestimmen sowohl die Höhe der maximalen spezifischen Produktbildungsrate als auch die Gesamtdauer des Prozesses. Moderne Ansätze zur Prozessoptimierung nutzen daher sowohl biologische (metabolic design) als auch verfahrenstechnische Eingriffe (process design). Am Beispiel der mikrobiellen L-Phenylalanin Herstellung aus Glycerin mit Escherichia coli konnten bereits mit Hilfe der Metabolischen Kontrollanalyse die limitierenden Reaktionen der mikrobiellen Produktsynthese zu verschiedenen Prozesszeitpunkten im Zulaufverfahren aufgezeigt werden. Hierzu wurden schnelle Medienwechsel und Kurzzeitexperimente in parallelisierten Analysereaktoren etabliert, um durch Zugabe unterschiedlicher Kohlenstoffquellen das metabolische Fließgleichgewicht der Zellen aus dem Produktionsprozess in unterschiedliche Richtungen auszulenken. Für die Kurzzeitanalysen (20 Minuten) konnten durch Expression von geeigneten Phosphat-Antiportersystemen auch Substrate wie Phosphoenolpyruvat eingesetzt werden. Durch Kombination stochastischer Methoden der metabolischen Kontrollanalyse und thermodynamische Analysen des Reaktionsnetzwerkes konnten die dabei ermittelten Metabolom- und Fluxomdaten zur Bestimmung der Kontrollparameter des Stoffwechsels von E. coli Stämmen genutzt werden. Dabei konnte erstmals gezeigt werden, wie sich die Kontrolle des Stoffwechsels zur L-Phenylalaninherstellung im Laufe des Produktionsprozesses verändert. Diese in enger Zusammenarbeit der beiden beteiligten Projektpartner (Georg Sprenger, Universität Stuttgart und Weuster-Botz, Technische Universität München) erfolgreich etablierte neue Methode der metabolischen Kontrollanalyse von Zellen aus Produktionsprozessen soll erweitert und auf die mikrobielle Herstellung der aromatischen Aminosäure L-Tryptophan aus Glycerin mit rekombinanten E. coli übertragen werden. Die Analyse der mikrobiellen L-Tryptophansynthese im Produktionsprozess erhöht die Komplexität des bisher betrachteten Stoffwechselnetzwerks erheblich. Dies betrifft vor allem die zusätzlichen Querverbindungen zwischen Aromatenbiosynthese und Zentralstoffwechsel durch die notwendige Serin- und 5-Phospho-D-Ribose-1-Diphosphat-Synthese. Zielsetzung ist die Identifikation kontrollierender Stoffwechselreaktionen des eingesetzten Produktionsorganismus zu ausgewählten Prozesszeitpunkten zur Herstellung von L-Tryptophan aus Glycerin mit rekombinanten E. coli im Zulaufverfahren. Neben der Stamm- und Prozessetablierung zur mikrobiellen L-Tryptophanherstellung sollen spezifische Transportersysteme für die Aufnahme wichtiger Stoffwechselintermediate etabliert werden, um mit Hilfe von Kurzzeitexperimenten, Fluxom-, Metabolom- und Transkriptomanalysen, sowie der metabolischen Kontrollanalyse die kontrollierenden Schritte im Stoffwechsel von E. coli im Produktionsprozess zu identifizieren und zur weiteren Stamm- und Prozessverbesserung zu nutzen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen