Funktionelle in vitro- und in vivo-Analyse der ringförmigen replikativen Helikase MCM2-7 zur Identifizierung von Proteinuntereinheiten, die eine Ringöffnung ermöglichen und damit das Laden und Ablösen der Helikase von DNS kontrollieren.

• Antragsteller: Dr. Stefan-Andreas Samel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2013
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 190035307

Bei der Replikation ist eine präzise zeitliche und örtliche Steuerung der Vorgänge essentiell, um die vollständige Duplikation der chromosomalen DNA und die genetische Integrität der Zelle zu bewahren. Der Gruppe um Herrn Dr. Speck ist es kürzlich gelungen, den ersten Schritt der DNA Replikation, das Laden der replikativen Helikase MCM2-7 auf die dsDNS mit gereinigten Proteinen in vitro zu rekonstruieren. Dieser Schritt, der als pre-replication complex formation (pre-RC) bezeichnet wird, ermöglicht nun die detaillierte Untersuchung dieser Reaktion. Das Laden des ringförmigen Proteinkomplexes MCM2-7 auf DNA erfordert den origin recognition complex (ORC) sowie die Proteine Cdc6 und Cdt1. Im Laufe dieser Reaktion muss sich der MCM2-7-Komplex öffnen, so dass die DNA in den zentralen Kanal gelangen kann. Es wird vermutet, dass diese Öffnung zwischen Mcm2 und Mcm5 erfolgt, da zwischen diesen beiden Proteinen keine Wechselwirkungen bestehen. Im Rahmen des beabsichtigten Forschungprojektes werde ich diese Hypothese mit dem rekonstruierten in vitro-Modell sowie mit in vivo-Experimenten prüfen. Dazu werde ich die Domänen des FK506- und Rapamycin-bindenden Proteins (FKBP) sowie des FKBP-Rapamycin bindenden Proteins (FRB) an die Untereinheiten Mcm2 und Mcm5 binden. Die so erhaltene Schnittstelle lässt sich kontrolliert ¿ durch Zugabe von Rapamycin ¿ schließen. In analoger Weise wird überprüft, ob die anderen Schnittstellen die Ringöffnung gestatten. Anschließend werden die Genkonstrukte in vivo auf ihre Fähigkeit hin untersucht, den pre-RC auszubilden bzw. den MCM2-7 Komplex nach Vollendung der Replikation abzulösen. Dieses Projekt bietet die Möglichkeit den Einfluss der Proteinschnittstellen auf die Ladung und Ablösung des MCM-Komplexes von DNA zu verstehen. Da MCM2-7 in Tumorzellen häufig verstärkt exprimiert wird, ist ein solides Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse wichtig, um in Zukunft in vivo kontrolliert in die Aktivität von MCM eingreifen zu können.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeber: Professor Dr. Christian Speck