Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren auf der Basis von Metallmarkierung (MeNAQ - Metal based Nucleic Acid Quantification)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Wir konnten zeigen, dass durch Kombination der neuartigen Metallmarkierung mit der Ligasekettenreaktion die für die DNA-Analytik nötigen niedrigen Nachweisgrenzen im attomolaren Bereich erreichbar sind, allerdings bisher nur in vereinfachtem Modellsystem (doppelsträngige 49mer Ziel-DNA in Wasser). Ein bedeutender Vorteil der Elementmarkierung für DNA-Assays ist die verglichen mit der Fluoreszenzmarkierung hohe Multiplexingkapazität. Dies wurde von HAN et al. mit einem ICP-MS-basierten 15-plex DNA-Assay demonstriert. Ein bedeutender Nachteil der Elementmarkierung besteht darin, dass die ICP-MS-Detektion prinzipiell nur für heterogene Assay-Formate geeignet ist; auf Fluoreszenzdetektion basierende homogene Assays hingegen sparen Arbeitsaufwand und sind geeignet für closed-tube DNA-Analysen nach real-time-Prinzip. Die Geräte- und Unterhaltskosten für ein Elementmassenspektrometer sind hoch, aber dafür bietet die ICP-MS instrumentelle Möglichkeiten, die für DNA-analytische Anwendungen attraktiv sind, beispielsweise die online-Kopplung mit der Kapillarelektrophorese (CE-ICP-MS) oder die Möglichkeit DNA-Microarrays mit Laserablations-ICP-MS (LA-ICP-MS) zu analysieren. Mit dem Ziel, die Sensitivität der DNA-Assays weiter zu erhöhen, wurde ein peptidbasierter Multimetallmarker entwickelt. Ein metalliertes DOTA-Aminosäurederivat wurde als Baustein in der Festphasenpeptidsynthese verwendet. Die Komplexierung schützte die DOTA-Carboxyl-Gruppen vor Aktivierung und Reaktion mit Aminogruppen und blieb während der Behandlung mit Trifluoressigsäure Abspaltung stabil. Diese neuartige Synthesestrategie könnte auch für die Darstellung von peptidbasierten Gdhaltigen MRI-Kontrastmitteln und peptidbasierten Lanthanoid-Fluoreszenz-Sonden geeignet sein. Für die Anwendung im ICP-MS basierten DNA-Assay wurden Peptide, die bis zu vier Metallatome enthielten, synthetisiert, an DNA-Sonden gebunden und im Assay angewandt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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DNA Quantification via ICP-MS Using Lanthanide-Labeled Probes and Ligation-Mediated Amplification, Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie, Berlin 2013
K. Brückner, S. Beck, M. W. Linscheid
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Peptide-Based Multi-Metal Tag for Biomolecule Labeling, Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie, Berlin 2013
K. Brückner, R. Zitterbart, M. W. Linscheid
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Strategies of immobilization of Metal-based Nucleic Acid and quantification by ICP-MS, Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie, Berlin, 2013
K. Schwarz, K. Brückner, S. Beck, M. W. Linscheid
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DNA Quantification via ICP-MS Using Lanthanide-Labeled Probes and Ligation-Mediated Amplification, Analytical Chemistry, 2014, 86, 585-591
K. Brückner, K. Schwarz, S. Beck, M. W. Linscheid
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Solid Phase Synthesis of Short Peptide-Based Multi-Metal Tags for Biomolecule Labeling, Bioconjugate Chemistry, 2014, 25(6), 1069-1077
K. Brückner, R. Zitterbart, O. Seitz, S. Beck, M. W. Linscheid
