Konfokales Laserscanning-Mikroskopsystem
Final Report Abstract
Das Mikroskop steht in der Core Facility des ZMBH und wird von mehreren Gruppen genutzt. Folgende Projekte wurden/und werden von der Arbeitsgruppe der Hauptantragstellerin bearbeitet: 1. Untersuchungen zur SUMO E3 Ligase RanBP2 in Kerntransport und Mitose: Eine Vielzahl von Studien deutet auf eine Funktion von SUMO für den Kern-Import und Export spezifischer Zielproteine hin. Unter anderem findet man eine E3-Ligase (RanBP2) und zwei Isopeptidases (Senp1 und Senp2) an Kernporenkomplexen. Seit längerem beschäftigen wir uns mit dem Mechanismus und der Funktion der von uns entdeckten SUMO E3 Ligase RanBP2. Ein Projekt, das wir intensiv verfolgen, ist der Aufbau und die Funktion eines faszinierenden Enzymkomplexes, der sich aus RanBP2, sumoyiertem RanGAP1 und Ubc9 zusammensetzt. In vitro konnten wir den Komplex rekonstituieren und seine E3 Ligase Aktivität nachweisen. Mit Hilfe des konfokalen Mikroskops konnten wir Interaktinen in vivo verifizieren und vollständige Kolokalisation von RanBP2 mit RanGAP1 quantitativ nachweisen. Dies war für die Frage essentiell, ob freies RanBP2 oder der Komplex in Zellen als SUMO E3 Ligase fungiert. Weiterführende Fragen sind zur Zeit: welche Proteine sind bona fide Substrate des RanBP2 E3 Ligase Komplexes, unter welchen zellulären Bedingungen tritt ihre Sumoylierung auf (in Interphase oder Mitose, Proliferation oder Differenzierung, unter normalen Wachstumsbedingungen oder nach Stress?), wie wird ihre Modifikation reguliert? 2. Untersuchungen zur Funktion der SUMO Isopeptidase USPL1: Vor einiger Zeit konnten wir mit Hilfe eines Suizid-Inhibitors eine neue SUMO Isopeptidase identifizieren, das Protein Ubiquitin specific proteases like 1 (USPL1). USPL1 gehört zur Familie der Ubiquitin Proteasen, ist aber für SUMO spezifisch. Nach Erzeugung von spezifischen Anktikörpern konnten wir zeigen, dass das sehr niedrig exprimierte Protein USPL1 in Cajal Bodies angereichert ist. USPL1 ist für Zellproliferation essentiell und knockdown führt zur Misslokalisation des Cajal Body Markers Coilin im Nucleolus. Interessanterweise lassen sich Proliferation und Coilin Lokalisation durch Transfektion einer katalytisch inaktiven Variante von USPL1 retten. Eine Funktion von USPL1 in snRNA Transkription konnten wir in Kollaboration mit dem Lamond Labor (Dundee) aufklären. Wir vermuten aber, dass USPL1 wie viele andere Ubiquitin- und SUMO Proteasen multiple Funktionen hat. Weiterführende Analysen sollen zur Identifikation von USPL1 Bindepartnern und sumoylierten Substraten führen, sowie die molekularen und zellulären Funktionen von USPL1 aufklären. 3. Eine Funktion der Ubiquitin E3 ligase SCF^Fbx5 in der zellzyklus-spezifischen Degradation des Aktin-Regulators EPS8: Cullin1 RING E3 Ligasen unterscheiden sich durch austauschbare Substratadaptoren, die sogenannten F-box Proteine. Diese sind für die Substratspezifität der CRL1 (SCF) E3 Ligase Komplexe zuständig. Die meisten der insgesamt 68 menschlichen Fbox-Proteine sind bisher wenig untersucht. Wir konnten kürzlich eine Funktion des Fbox Proteins Fbxw5 aufklären: SCF^Fbxw5 führt zum Abbau des Aktin Regulators EPS8 spezifisch in der G2 Phase des Zellzyklus. Reduktion der Eps8 Menge trägt zur Abrundung mitotischer Zellen bei. Abwesenheit von EPS8 in der späten Mitose führt aber zu Verlust an Stabilität des Zellkortex, was sich durch einen ausgeprägten "blebbing" Phenotyp zeigt. Eine spannende Frage der wir momentan nachgehen ist der Mechanismus der zellzyklus-abhängigen Erkennung von Eps8 durch SCF^Fbxw5.
Publications
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(See online at https://doi.org/10.1091/mbc.E13-09-0526)
