Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie-Messplatz
Zusammenfassung der Projektergebnisse
1. Forschungsprojekt: SFB 894, TP A2 (Niemeyer/Peinelt). In diesem Projekt wurde die Kinetik der Clusterformation an der Plasmamembran von wt und mutierten Orai1 und STIM1 Komponenten des speicher-aktivierten Calciumeinstroms durch CRAC Kanäle quantitativ mit TIRF Mikroskopie analysiert. Dabei wurden eine Reihe von STIM1 Mutationen analysiert, die für die Orai-Aktivierung relevant sind. Diese Daten wurden mittels eines Diffusionsreaktionsmodells für die STIM-Orai Diffusion im Rahmen des SFB 1027 TP A3 (Rieger) modelliert. 2. Forschungsprojekt: SFB 1027, TP A3 (Rieger) mit TPs A2 (Hoth/Qu)/C4 (Niemeyer/Bogeski). In diesem theoretischen Projekt zur Modellierung von Ca2+ Signalen in T-Zellen in Abhängigkeit der Mitochondrienlokalisation sowie der STIM-Orai Interaktion wurden mit dem Gerät durchgeführte TIRF Messungen an T-Zellen herangezogen. 3. Forschungsprojekt: SFB 1027, TP C4 (Niemeyer/Bogeski). In diesem Projekt wurde das TIRF Mikroskop genutzt, um zu quantifizieren, ob und wie stark die STIM1-vermittelte Clusterbildung von Orai2 und Orai3 Kanälen an der Plasmamembran von der Anwesenheit von Orai1 abhängt. Mit verschieden-getaggten Proteinen wurden die relativen Fluoreszenzanteile der verschiedenen Proteine in den Clustern an der Plasmamembran quantifiziert. Neben dem Einsatz im TIRF mode wurde das Mikroskop für dieses Projekt aufgrund des schnellen z-Motors auch als Fluoreszenzmikroskop für die schnelle Aufnahme in mehreren Ebenen genutzt. 4. Forschungsprojekt: SFB 894, TP A1 (Hoth). Wir haben mit dem TIRF Mikroskop die Exozytose von lytischen Granula in zytotoxischen T-Lymphozyten quantifiziert, insbesondere haben wir dabei die Freisetzung von Granzym B- oder Perforin-enthaltenden lytischen Granula analysiert. Dabei waren Granzym B und Perforin mit Flureszenzproteinen getaggt und wurden in den primären menschlichen T-Zellen durch Transfektion exprimiert. Für diese Messungen wurde eine Immunologische Synapse zwischen dem Glas (durch das Aufbringen verschiedener Antikörper) sowie der zytotoxische T-Zelle etabliert. Im Rahmen dieser Messungen haben wir auch die extrazelluläre Ca 2+ Konzentration und damit den Ca2+-Einstrom über die Synapse durch Orai Kanäle variiert. Wir haben gefunden, dass man eine optimale Exozytose von Granzym B bei mittleren Ca2+-Konzentrationen erhält. Derzeit arbeiten wir daran, die intrazelluläre Ca2+-Konzentration und die Freisetzung lytischer Granula mit einer möglichst guten Zeitauflösung parallel zu messen. 5. Forschungsprojekt: SFB 1027, TP A2 (Qu/Hoth) mit A1 (Kruse/Doubrovinski) und A3 (Rieger). Da das TIRF Mikroskop aufgrund des ultraschnellen z-Motors in der Lage ist, sehr schnelle z-stacks aufzunehmen, nutzen wir das Mikroskop auch, um einzelne lytische Granula sowie Mitochondrien als auch Zytoskelettstrukturen in drei Dimensionen während der Bildung der Immunologischen Synapse zu verfolgen. Im Rahmen des SFB 1027 interessiert und hier insbesondere die Dynamik der Bildung der Immunologischen Prozesse und der (kollektive) Transport einzelner Organellen/Zytoskelettstrukturen während der Bildung. Diese Dynamik bedingt sehr wahrscheinlich die Dauer der Ausbildung der Immunologischen Synapse. Dieser Parameter ist von enormer Relevanz für die Effizienz der Abtötung von Krebszellen durch zytotoxische Zellen des Immunsystems.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Interplay of channel, pumps and organelle location in calcium microdomain formation. New Journal of Physics 15, 1- 25, 2013
Peglow M, Niemeyer BA, Hoth M, Rieger H
- Mutations of the Ca2+ -sensing Stromal Interaction Molecule STIM1 Regulate Ca2+ Influx by Altered Oligomerization of STIM1 and by Destabilization of the Ca2+ Channel Orai1. Journal of Biological Chemistry 288, 1653-1664, 2013
Kilch T, Alansary D, Peglow M, Dorr K, Rychkov G, Rieger H, Peinelt C, Niemeyer BA
