Analysis of supramolecular assemblies of NE81, the first lamin-like protein in a unicellular organism
Evolutionary Cell and Developmental Biology (Zoology)
Final Report Abstract
Lamine waren schon lange als Hauptbestandteil der nukleären Lamina von Metazoen bekannt. Mit der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung eines Lamin-ähnlichen Proteins (NE81) in Dictyostelium discoideum (Amoebozoa) in unserem Labor und daraus resultierender Identifizierung weiterer solcher Proteine in anderen eukaryotischen Supergruppen wurde klar, dass Lamine schon zur Ausstattung des letzten gemeinsamen Vorfahren aller Eukaryoten (LECA) gehörten. Damit erschien Dictyostelium auf einmal als weiteres interessantes Modell zur Erforschung von Laminfunktionen bis hin zu Laminopathien. Zu dieser Modellfunktion fehlten allerdings zu Beginn des Projekts noch klare Daten unter welchen Bedingungen NE81 Filamente und Filamentassemblies bilden kann und wie diese strukturell organisiert sind. Hierzu sollten mit verschiedenen Tags (HisMyc, FLAG, GFP) markierte NE81 Varianten in verschiedenen Systemen (zellfrei per in vitro Translation, in Xenopus Oocyten, in Bakterien und in Dictyostelium) exprimiert werden und entsprechende supramolekulare Assemblies sowohl an Kernmembranen als auch nach in vitro Polymerisation mit Hilfe von Elektronenmikroskopie (TEM, SEM) und hochauflösender Lichtmikroskopie strukturell analysiert werden. Nicht alle geplanten Ansätze führten zum Erfolg, schließlich gelang es uns aber sowohl NE81 erfolgreich in Xenopus Oocyten zu exprimieren und per Rasterelektronenmikroskopie zu analysieren, als auch eine lösliche NE81 Variante (ohne funktionelle CaaX-Box und Kernlokalisationssequenz - NLS) in größeren Mengen aus Dictyostelium Amöben aufzureinigen. Das Protein zeigte ein salzabhängiges reversibles Assembly in vitro. Die in vitro Assemblies wurden nach Negativkontrastierung transmissionselektronenmikroskopisch untersucht und per STED und Expansion-Microscopy (ExM) lichtmikroskopisch analysiert. Es zeigten sich dabei so große Ähnlichkeiten zu B-Typ Laminen aus Metazoen, dass das bisher als Lamin-ähnliches Protein benannte NE81 nun endgültig als Lamin bezeichnet werden muss. Die innovative ExM-Methode wurde in diesem Zusammenhang von uns auch erstmals im Dictyostelium-Modell angewandt und publiziert. Letztendlich war dieses schwierige Projekt ein großer Erfolg. Mit dem schlussendlichen Beweis, dass NE81 als echtes Lamin betrachtet werden sollte, kann man Dictyostelium nun mit Recht als Modellsystem für die Erforschung von Laminen ansehen.
Publications
- (2015) Evolution of centrosomes and the nuclear lamina: Amoebozoan assets. Eur. J. Cell Biol. 94, 249 - 256
Gräf, R., Batsios, P., and Meyer, I.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ejcb.2015.04.004) - (2016) Src1 is a protein of the inner nuclear membrane interacting with the Dictyostelium lamin NE81. Cells, 5, (1)
Batsios, P., Ren, X., Baumann, O., Larochelle, D.A. and Gräf, R.
(See online at https://doi.org/10.3390/cells5010013) - (2019) Supramolecular Structures of the Dictyostelium Lamin NE81. Cells, 8, 162
Grafe, M., Batsios, P., Meyer, I., Lisin, D., Baumann, O., Goldberg, M.W. and Gräf, R.
(See online at https://doi.org/10.3390/cells8020162)
