Analyse supramolekularer Assemblies von NE81, dem ersten Lamin-ähnlichen Protein eines einzelligen Organismus

• Antragsteller: Professor Dr. Ralph Gräf
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Evolutionäre Zell- und Entwicklungsbiologie der Tiere
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 180581162

Lamine bilden die nukleäre Lamina. Unsere Entdeckung von NE81 als erstem Lamin-ähnlichen Protein in einem Amoebozoen zeigt, dass Lamine bereits sehr früh zusammen mit den Unikonten evolviert sind. Zur Struktur der nukleären Lamina ist bei niederen Eukaryoten bisher wenig bekannt. Die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung der Kernhülle von NE81 exprimierenden Xenopus Oocyten zeigte filamentöse Strukturen, die denen von B-Typ Laminen gleichen. Für ein besseres Verständnis der Assemblies von Lamin-ähnlichen Proteinen schlagen wir folgendes Arbeitsprogramm vor.1. Untersuchung der Assemblierung von löslichem NE81: Wir konnten zeigen, dass NE81 ohne NLS und CaaX-Box reversibel supramolekulare Strukturen im Cytoplasma von Dictyostelium ausbildet. Wir wollen NE81xNLSxCLIM aus Dictyostelium mit proteinbiochemischen Zentrifugations- und Chromatographietechniken aufreinigen, um anschließend in vitro Assemblierungsversuche durchführen zu können. Die Analyse von negativ kontrastierten in vitro-Assemblies soll elektronenmikroskopisch erfolgen.2. Analyse der Assemblierung von NE81xNLS an der äußeren Kernhülle. Abgesehen von der Assemblierung des embryonalen Xenopus Lamin LIII in Oocyten ist wenig über die Struktur membranassoziierter Assemblies anderer Lamine bekannt. Dies beruht auf der nicht vorhandenen Zugänglichkeit der inneren Kernhülle in anderen Systemen und der dort engen Assoziation der nukleären Lamina mit dem Chromatin. Wir konnten bereits zeigen, dass NE81 ohne funktionelle NLS (GFP-NE81xNLS) reversible Assemblies an der äußeren Kernhülle ausbildet. Diese sollten für ultrastrukturelle Oberflächenanalysemethoden frei zugänglich sein, wenn diese an isolierten Kernen angewandt werden. Daher möchten wir Oberflächenstrukturen an aus NE81xNLS Zellen isolierten Kernen mit Hilfe von Kraftmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie analysieren.3. Untersuchung membranassoziierter Assemblies von NE81 im zellfreien System: Als alternativen Ansatz zur Darstellung membranassoziierter Assemblies Lamin-ähnlicher Proteine wollen wir NE81 mit Sf21 Zellextrakten und GUVs (giant unilamellar vesicles) exprimieren. Die erfolgreiche Lokalisation von CaaX-Box Proteinen an GUVs wurde bereits gezeigt, ebenso die erfolgreiche Expression von NE81 durch in vitro Translation. Die Voraussetzungen für die Ausbildung von supramolekularen Assemblies eines Lamin-verwandten Proteins an der äußeren Oberfläche von GUVs sind somit gegeben. Wie oben sollen die Assemblies durch Kraftmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie untersucht werden.4. Anwendung der im Projekt etablierten Methoden an Vertebraten-Lamine. Beide Strategien zur Darstellung membranassoziierter NE81 Assemblies bilden auch einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung solcher Strukturen von Laminen höherer Organismen. Zum Nachweis der Anwendbarkeit wollen wir unsere Methoden zunächst anhand von Xenopus Lamin LIII testen, da hier die besten Strukturdaten zum Vergleich vorliegen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen