Lysophopholipide, speziesübergreifende Marker pathologischer Veränderungen an Spermien
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Eine verminderte Spermienqualität ist ein zunehmend adressiertes Problem in der Reproduktionsmedizin des Menschen. Das gilt ebenso für Tierarten, wo die Reproduktion nicht - wie bei den meisten landwirtschaftlichen Nutztieren - speziell Gegenstand der Zuchtstrategie ist, bzw. wo nur die natürlichen Selektionsmechanismen greifen, wie es bei den meisten bedrohten Arten der Fall ist. Umweltbelastungen sowie Überalterung (Mensch und Zootiere) tragen dabei wesentlich zur Verminderung der Spermaqualität bei. Bislang existieren kaum sensitive, analytische Verfahren, die eine speziesübergreifende, einfache Beurteilung der Spermienqualität mit Relevanz für den Befruchtungserfolg ermöglichen. In der ersten Förderperiode des Projekts wollten wir mittels massenspektrometrischer (MS) Verfahren Lysophospholipide (LPL) als einfach detektierbare Lipid-Biomarker für die Spermienqualität etablieren, die ein Produkt der Lipidoxidation in Folge pathologischer Prozesse sein können. Wir fokussierten uns auf das Lysophosphatidylcholin (LPC), da Phosphatidylcholine (PC) in den Spermien aller Tierarten und beim Menschen in großen Mengen vorhanden sind. LPC wird sowohl durch reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS) wie auch bei Aktivierung von Phospholipasen generiert. In sehr geringen Mengen ist es Bestandteil physiologischer Signalprozesse, sollte aber unter pathologischen Bedingungen spermienschädigende Konzentrationen annehmen. Allerdings zeigte sich, dass LPC lediglich im Falle schwerer metabolischer Imbalancen in frisch gewonnenen Ejakulaten akkumuliert wurde (z.B. bei stark adipösen Probanden) und deshalb nur eingeschränkt als Biomarker geeignet ist. In vielen Tierspermien ist die LPC-Konzentration nahe an der Nachweisgrenze. In der zweiten Förderperiode sind wir daher der Frage nachgegangen, warum LPC in fast allen Spermaproben nur in sehr geringen Mengen nachweisbar ist. Letzteres fanden wir auch nach Analyse von Proben von Individuen mit geringerer Fruchtbarkeit (Eber, Bulle). Wir konnten zeigen, dass bereits geringste Mengen an LPC (< 5% der Membranlipide) spermientoxisch sind und in der Spermienmembran vermutlich ähnlich Detergentien agieren. Wir haben uns deshalb verstärkt mit den protektiven Mechanismen beschäftigt, die die LPL-Akkumulation verhindern sowie mit Mechanismen der weiteren Metabolisierung bzw. Entfernung von LPL aus dem Spermien. Im Seminalplasma (SP) sind protektive enzymatische und nichtenzymatische antioxidative Komponenten bekannt. Wir haben die Kapazität im SP zur Reduktion von Fettsäureradikalen mittels ESR bestimmt. Ist sie zu gering, kann es in Einzelfällen bei Mensch und Rind zur Akkumulation von LPC kommen. Beim Löwen korrelierte die Radikalreduktionskapazität mit der Qualität kryokonservierter Spermien nach dem Auftauen, jedoch ohne Bezug zu LPC-Konzentrationen, die auch nur in Einzelfällen erhöht waren. Die Radikalreduktionskapazität im SP korrelierte bei Mann, Bulle und Löwe mit dem Proteingehalt. Dies ist vermutlich durch die hochreaktiven funktionellen Gruppen (insbesondere Thiol-, Thioether-, und Aminogruppen) in den Proteinen begründet. Proteine im SP haben offenbar auch eine Akzeptorfunktion für die schädlichen LPL, da LPC in größeren Mengen an Proteinen gebunden vorgefunden wurde (insbesondere beim Hengst). Deshalb war LPC nach der von uns verwendeten Extraktionsmethode (Chloroform/Methanol) zur Isolation von Lipiden nur ungenügend nachweisbar, da es nur in geringem Maße in der organischen Phase auftaucht. Immerhin war der LPC-Anteil im SP generell etwas höher als in den Spermien. Darüber hinaus wird LPC (durch bislang noch weitgehend unbekannte Mechanismen) zu wasserlöslichen Verbindungen wie z.B. Glycerophosphorylcholin (GPC) abgebaut. Dies könnte den Fakt erklären, dass sich im SP fast aller Spezies große Mengen an GPC finden, und GPC die dominierende Resonanz in den NMR-Spektren ist. Während in den Spermien keine Proteinexpression stattfindet, ist der Lipidstoffwechsel aktiv. Wir konnten an den besonders kältesensiblen Eberspermien zeigen, dass die Supplementierung des Verdünners mit Fettsäuren die Kälteresistenz der Spermien verbessert, was auf den nachgewiesenen Einbau dieser Fettsäuren in Phospholipide und Diacylglycerol zurückzuführen sein kann. Die Unterstützung der Reparatur oxidierter Lipide damit eine potenzielle Schutzmaßnahme für „gestresste“ Spermien im Rahmen der assistierten Reproduktion. Alle von uns untersuchten Prozesse (Schutz der Lipide, Abbau und Reparatur von LPL) sind in ihrer Effizienz speziesspezifisch, was ihre Anpassung an das jeweilige Reproduktionssystem nahe legt. Wir bereiten unter diesem Aspekt noch eine vergleichende Studie zur Publikation vor und planen ein Folgeprojekt unter Einbeziehung von vergleichenden Metabolom- und Einzelzell-Analysen sowie Analysen charakteristischer Lipide in Mitochondrien, dem primären Ort der ROS-Generierung.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2020) MALDI MS Analysis to Investigate the Lipid Composition of Sperm. CAC (Current Analytical Chemistry) 16 (1) 79–91
Engel, Kathrin M.; Jakop, Ulrike; Müller, Karin; Grunewald, Sonja; Paasch, Uwe; Schiller, Jürgen
(Siehe online unter https://doi.org/10.2174/1573411014666181030123256) - (2016) MALDI-TOF MS to monitor the kinetics of phospholipase A2-digestion of oxidized phospholipids. Methods 104: 41-47
Schröter J, Süß R, Schiller J.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.12.013) - (2017) A comparison of PC oxidation products as detected by MALDI-TOF and ESI-IT mass spectrometry. Chem Phys Lipids 203: 33-45
Engel KM, Schiller J.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.chemphyslip.2016.12.007) - (2017) Semen cryopreservation and radical reduction capacity of seminal fluid in captive African lion (Panthera leo). Theriogenology 89: 295-304
Luther I, Jakop U, Lueders I, Tordiffe A, Franz C, Schiller J, Kotze A, Müller K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.10.024) - (2017) The phospholipid composition of kangaroo spermatozoa verified by mass spectrometric lipid analysis. Lipids 52: 857-869
Engel KM, Schiller J, Müller K, Dannenberger D, Jakop U
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s11745-017-4283-9) - (2018) Modification of sperm fatty acid composition during epididymal maturation in bats. Reproduction 157: 77-85
Fasel N, McMillian K, Jakop U, Méné-Saffrané L, Engel K, Genoud M, Müller K, Christe P
(Siehe online unter https://doi.org/10.1530/REP-18-0463) - (2018) Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules E173
Leopold J, Popkova Y, Engel KM, Schiller J
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/biom8040173) - (2019) Assisted reproduction for felid species conservation – sperm competences at risk. Reprod Dom Anim, 00:1–6
Müller K, Eder S, Jakop U, Schiller J, Müller P, Bashawat M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/rda.13581) - (2019) Automated semen analysis by SQA Vision® versus the manual approach-A prospective double-blind study. Andrologia 51:e13149
Engel KM, Grunewald S, Schiller J, Paasch U
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/and.13149) - (2019) In vitro supplementation with unsaturated fatty acids improves boar sperm viability after storage at 6°C. Anim Reprod Sci 206: 60-68
Jakop U, Svetlichnyy V, Schiller J, Schulze M, Schroeter F, Mueller K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2019.05.008) - (2019) Metabolomic profiling reveals correlations between spermiogram parameters and the metabolites present in human spermatozoa and seminal plasma. PLoS One 14: e0211679
Engel KM, Baumann S, Rolle-Kampczyk U, Schiller J, von Bergen M, Grunewald S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211679) - (2019) Normal-phase versus reversed-phase thinlayer chromatography (TLC) to monitor oxidized phosphatidylcholines by TLC/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 33 (Suppl 1): 60-65
Engel KM, Griesinger H, Schulz M, Schiller J
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/rcm.8237)
