tRNA-dependent Biosynthesis of Phospholipids in Pseudomonas aeruginosa

• Antragsteller: Professor Dr. Dirk Heinz; Dr. Jürgen Moser
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2009 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 162323379

Die bakterielle Lipid-Homöostase spielt eine entscheidende Rolle bei der Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen, so auch während einer antimikrobiellen Therapie. Die ungewöhnliche, tRNA-abhängige Aminoacylierung des Phospholipids Phosphatidylglycerol durch Alanin oder Lysin wird von Aminoacyl-Phosphatidylglycerol Synthasen katalysiert und führt zu einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber unterschiedlichen antimikrobiellen Agenzien. Kürzlich konnten wir die Synthese von Alanyl-Phosphatidylglycerol (A-PG) für das Gram negative Pathogen Pseudomonas aeruginosa nachweisen. Die Bildung von A-PG führte sowohl zu einer erhöhten Resistenz in Gegenwart von unterschiedlichen antibakteriellen Substanzen, unter sauren Bedingungen als auch in Anwesenheit von Laktat. Vor kurzem ist es uns gelungen die Kristallstruktur für den löslichen Teil der Alanyl-Phosphatidylglycerol Synthase (A-PGS) aufzuklären. Im Mittelpunkt des Antrags steht die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der A-PGS im Komplex mit einem neu-synthetisierten Inhibitor, welcher das 3´-terminale Ende des natürlichen tRNA Substrates imitiert. Gleichzeitig möchten wir auch die Kristallstruktur einer orthologen Lysyl-Phosphatidylglycerol Synthase aufklären, um somit wesentliche Unterschiede bei der Substraterkennung zu entschlüsseln. Für die Cokristallisation beider Systeme sollen vielfältige Strategien verfolgt werden. Zur Analyse der Substraterkennung sollen katalytische Proteinfragmente gemeinsam mit unserem neu synthetisierten Inhibitor Alapuromycin, zusammen mit tRNA oder aber in Gegenwart von tRNA Microhelices cokristallisiert werden. Zur weiterreichenden Analyse der kürzlich demonstrierten Flippase-Aktivität von Aminoacyl-Phosphatidylglycerol Synthasen soll sowohl das gesamte Membranprotein als auch ein spezifisches membranständiges Proteinfragment des P. aeruginosa Enzyms eingesetzt werden. Weiterhin möchten wir die biologische Funktion des P. aeruginosa Orfs PA0919 aufklären, der sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur A-PGS befindet. Die phänotypische Charakterisierung unserer bisherigen Knockout-Mutanten und auch unsere biochemischen Experimente deuten auf eine Katalyse unter Verwendung von A-PG als Substrat hin. Die vorgeschlagene Funktion bei der Lipid-Homöostase spielt möglicherweise auch eine Rolle bei verschiedenen orthologen Proteinen, die als Bestandteil von Typ IV Sekretionssystemen beschrieben wurden. Eine mögliche lipidmodifizierende Aktivität dieser homologen Proteine soll analysiert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen